rip

技术概述

rip是研究体内蛋白与rna互作的重要技术。由于线粒体有着与真核生物长期共生的进化历史，因此其基因组包含了反映物种进化的关键信息，同时，相对于核基因组，线粒体基因组小，容易对大量物种进行横向的比较分析，有利于生物进化的研究，因而受到进化生物学家的---。该技术先用甲醛等试剂交联细胞内的“蛋白-rna”互作复合物，裂解细胞后，用靶蛋白特异的抗l体(或标签抗l体)做免l疫沉淀，获得“靶蛋白-rna”互作复合物，去交联分离其中的rna;针对预测的靶蛋白结合rna的序列设计引物，

做qpcr实验，验证预测的rna是否与靶蛋白有结合，或者将分离出来的rna做高通量测序，筛选到可能与靶蛋白结合的rna。

技术流程

细胞交联-***细胞裂解-***免l疫共沉淀***去交联***rna分离***建库***高通量测序(或qpcr)。

单细胞测序（英语：single cell sequencing）采取优化的下一代dna测序技术（ngs）检测单细胞的序列，可以获得特定微环境下的细胞序列差异以方便研究其功能差异等。对个体细胞的dna测序可以帮助我们了解例如在中的小范围细胞的变异；对其进行rna测序可以帮助我们了解和鉴别不同的细胞类型与其表现的基因，对研究发育生物学等有较大裨益。离心后吸上清液400u1移入相应编号的ep管中，再加入400ul异充分混匀。

分离单细胞

在全基因组扩增和测序前，有很多方法可以分离细胞个体，其中流式细胞术（facs）较为常用。个体细胞可以用显微操作来收集，这样较为快捷而且成本较低，但是比较有技术难度，而且显微镜下对细胞的错误分类容易影响实验结果。激光捕获显微切割技术（lcm）亦可以用来收集单细胞。5、滴度检测:细胞为30%－50％时加入---上清液，检测阳性细胞比例。但是尽管激光捕获显微切割可以保留样本细胞在组织中的空间位置，但是捕获单细胞的时候容易连带周围细胞的物质。高通量的细胞个体分离还可以使用微流控技术。微流控技术和流式细胞技术都能准确而自动地分离无偏样本。但是，两种方法都要求首先将细胞从其为环境中脱离，因此可能在rna表达分析中造成对转录数据的干扰。

7.如何检测引物的纯度？

答：实验室方便的作法是用page方法。使用加有7m尿素的16%的聚---凝胶进行电泳。取0.2-0.5od的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。(2)等电---完毕后(约需24hr），若不立即进行第二相电泳，胶条可夹在两层塑料薄膜中于-70℃保存数月。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600v电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光tlc板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用eb 染色或银染方式染色。

而有的厂家提供maldi-tof质谱qc控制，从而保障了合成的准确率：

bioneer使用多重maldi-tof质谱仪进行全自动装载及监测。 每份样品的质谱分析数据将自动插入到寡核苷酸的信息单中。(一)水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。bioneer是上仅有的几个对生产的每份核苷酸 (单个寡核苷酸和高通量和成) 都用maldi-tof质谱仪检测进行核苷酸qc检测的厂商，而且免费提供质谱数据。

8.如何计算引物的浓度？

答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成10-50pmol/ul。 一般情况下，建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：v (微升)= od数*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。平台成熟---：采用agilent原位喷墨合成技术，了高检测灵敏度和特---。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。

注意：1 od260= 33 ug/ml.