细胞实验介绍——慢---建立稳转细胞系
慢---包装：公司使用3质粒慢---包装系统，慢---系统使用plko.1-egfp、pspax2、pmd2.g，动物 细胞实验服务，过表达慢---系统使用plvx-acgfp、pspax2、pmd2.g三质粒系统，将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法转染至hek293t细胞中，培养48h后，收集上清。使用genecopo公司慢---颗粒纯化试剂盒将慢---纯化。纯化后留取部分检测---滴度，其余---冻存于-80℃冰箱中。
滴度检测：将---颗粒使用梯度稀释，分别293t细胞，72h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算---滴度。
细胞：在---前---对细胞进行计数，接种约10000个细胞于12孔板中，培养过夜后使用无培养基稀释---，加入12孔板中对细胞进行，---数量根据细胞的moi加入（若无moi，需做---梯度：1，5，10，50，100 5个梯度对细胞），6h后去除含---溶液，加入完全培养基细胞培养，培养48h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。同时加入puromycin对细胞筛选，南京实验服务，筛选约2周时间。细胞筛选好后，使用定量pcr和western blot检测目的基因的稳定表达情况。
实验流程：慢---质粒构建-hek293t细胞培养-质粒转染293t细胞----收集----纯化----滴度检测-细胞-稳转细胞筛选-稳转细胞鉴定
结果示例：
图 a ---滴度检测；b 目的细胞---效果图
三、自噬过程进行观察和检测
1、观察自噬体的形成
由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。phagophore的特征为:新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(av1 )的特征为:双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(av2 )的特征为:单层膜，胞浆成分己降解。( autophagic vacuolo av )
2、在荧光显微镜下采用gfp-lc3融合蛋 白来示踪自噬形成由于电镜耗时长，不利于监测(monitoring) 自噬形成，人们利用lc3在自噬形成过程中发生---的现象开发出了此技术。无自噬时，gfp-lc3融合蛋 白弥散在胞浆中;自噬形成时，gfp-lc3融合蛋白转 位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。
3、利用western blot检测lc3-ii/比值的变化以评价自噬形成自噬形成时，胞浆型lc3 (即 lc3-i)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即lc3-id，因此，lc3-ii/比值 的大小可估计自噬水平的高低。(注意: lc3对lc3-ii有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。)
4、mdc (monodansylcadaverine ，单丹---尸胺)染色:包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特---的。
5、celltrackertm green染色:主要用于双染色，但其能染所有的液泡，细胞实验外包服务，故也属于非特---的。
cell counting kit-8（简称cck-8）是一种基于wst-8的广泛应用于---和细胞毒性的检测试剂。wst-8化学名：2-(2-甲氧ji-4-硝ji---ji)-3-(4-硝ji---ji)-5-(2，4-二磺酸---)-2h-四唑单钠盐，是一种类似于mtt的化合物，它在电子载体1-甲氧ji-5-甲ji吩---鎓---二jia酯（1-methoxy pms）存在的情况下，被线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物（formazan）。---越多越快，颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅，细胞侵袭实验服务，对于同样的细胞，颜色的深浅与活xi胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行---和毒性分析。
南京实验服务-英瀚斯-细胞侵袭实验服务由南京英瀚斯生物科技有限公司提供。行路致远，---。南京英瀚斯生物科技有限公司（www.enhancer-bio.com/）致力成为与您共赢、共生、共同前行的---，与您一起飞跃，共同成功!
联系我们时请一定说明是在100招商网上看到的此信息，谢谢！
本文链接：https://tztz316162.zhaoshang100.com/zhaoshang/206966364.html
关键词：
滇公网安备 53011202000392号