分子生物检测技术-英瀚斯-南京分子生物检测

mirna测序

microrna(mirna)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子rna，分子生物检测技术，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链rna前体经过dicer酶加工后生成，不同于sirna（双链）但是和sirna密切相关。microrna通过和靶基因mrna碱基配对引导沉默复合体（risc）降解mrna或抑制mrna的翻译，从而在转录后水平调控蛋白表达（新发现mirna也能在转录水平调控基因表达）。mirna在物种进化中相当保守，在动物、植物和---等中发现的mirna表达均有严格的组织特---和时序性。mirna在细胞生长和发育过程中起多种作用，包括调控发育、分化、凋亡和增殖等。

目前研究mirna的方法主要是realtime-pcr、生物芯片技术以及第二代测序技术。基于第二代测序技术的mirna测序，可以一次获得数百万条mirna序列，能够快速鉴定出不同组织、不同发育阶段、不同---状态下已知和未知的mirna及其表达差异，为研究mirna对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。

rna提取

1.弃去培养液，用pbs清洗两次1-2。

2.弃去pbs，用1000u1枪吸干净残余pbs。

3.加1ml trizol研磨b 41。

4. 1.5miep管标号与每孔相对应备用。

5.研磨好的溶液转移至对应的 ep管。

6.往每个ep管中加入250ul，剧烈震荡30s， 冰上静置12min[问l。

7. 所有样品4c离心，转速: 13500转1分钟，时间: 15min.

8. 再次标记一批同样编号ep管。

9.离心后吸上清液400u1移入相应编号的ep管中，再加入400ul异充

分混匀。4c冰箱35min。

10. 4c离心，转速: 13500转1分钟，时间: 10min.

11.弃去.上清液，加1m175%---，轻摇7]。

12. 4c离心，10600转/分钟，时间: 5min.

13. 弃上清液滤纸吸干。

14. 加depc水10ul溶解，-80c保存。进行逆转录前测浓度。

组织rna提取

1、剪米粒大小组织块放入ep管中标号。

2、ep管中加300ul trizol浸泡30分钟或更久。

3、用研磨棒研磨，以肉眼很难看到组织为宜。

4、加700u1 trizol静 置5分钟。