英瀚斯-分子生物检测技术-南京分子生物检测

dna测序检测

1. pcr测序反应

(1)取0.2ml的pcr管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂:

所加试剂测定模板管标准对照管

bigdye mix

1μl

1μl

待测的质粒dna

1μ 1

pgem-3zf (+)双链dna

-1μ1

待测dna的正向引物

1μ 1

m13(-21)引物- 1μ 1

灭菌去离子水

2μ 1

2μ 1

总反应体积5μ 1，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧pcr管，用手指弹管混匀，稍离心。

(2)将pcr管置于9600或2400型pcr仪.上进行扩增。98c变性2min后进行pcr循环，

pcr循环参数为96c 10s， 50c 5s， 60°c4min， 25 个循环，扩增结束后设置4c保温。

2.---法纯化pcr产物

(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml ep管中。

(2)加入25μ 1/---混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀dna。12 000r/min于

4c离心30 min，小心弃上清。

(3)加70%(v/v)的---50μ 1 洗涤沉淀2次。12 000r/min 于4c离心5min，小心弃上清和

管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。

3.电泳前测序pcr产物的处理。

(1)加入12μ 1的tsr于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解dna沉淀，分子生物检测技术，稍离心。

(2)将溶液转移至盖体分离的0.2ml pcr管中，小分子生物检测服务，稍离心。

(3)在pcr仪上进行热变性(95c 2min)，冰中骤冷，待_上机。

4..上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立

运行的测序顺序文件。

5.仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过

序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。

6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。

慢性肺阻塞模型

方法:采用被动---法建立copd大鼠模型，南京分子生物检测，随机分为被动---4周组、6周组、8周组和对照组，分别测定和评估不同时间段的各组大鼠模型的肺功能和气道肺组织的病理变化结果:6周组及8周组大鼠模型的呼气峰流速(pef)---降低、气道内压上升坡度(ip-slope)---zeng高，与对照组比较p < 0.01.以pef值小于对照组的大鼠80%pef值为存在气流受限的界线，则4周组、6周组、8周组出现气流受限的鼠分别为0只(0)、6只(75%)及8只(100%)，6周组及8周组的大鼠气流受限发生率---高于4周组(p< 0.01).8周组大鼠出现明显气道壁增厚、气道狭窄及 ---肺qi肿改变，气道壁炎细胞浸润、杯状细胞化生、气道壁坏死糜lan、纤维结缔组织及---增sheng等评分均---高于对照组(p < 0.01)，气道坏死糜lan、小气道阻塞发生率级气道---增sheng等指标---高于6周组(p < 0.01).6周组中有6大鼠出现气道狭窄及肺qi肿改变，气道壁炎细胞浸润、杯状细胞化生、气道壁坏死糜lan、纤维结缔组织及---增sheng等评分均---高于对照组(p < 0.01).6周组及8周组大鼠pef值与气道壁纤维组织和---增sheng呈---负相关(p < 0.05);而4周组大鼠未出现典型肺qi肿及气道狭窄结论:copd的形成与---时间有关，分子生物检测，在---量相同条件下，---时间越长，气道和肺组织病变越重，气流受限的发生率越高.