分子与质粒载体构建
实验原理
外源dna与载体分子的连接就是dna重组，这样重新组合的dna叫做重组体或重组子。重组的dna分子是在dna连接酶的作用下，有mg2+、atp存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源dna分子进行连接。dna连接酶有两种：t4噬菌体dna连接酶和大肠dna连接酶。两种dna连接酶都有将两个带有相同粘性末端的dna分子连在一起的功能，而且t4噬菌体dna连接酶还有—种大肠连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链dna分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高t4噬菌体dna连接酶浓度或增加dna浓度来提高平末端的连接效率。
t4噬菌体dna连接酶催化dna连接反应分为3步：，t4dna连接酶与辅助因子atp形成酶—amp复合物；然后，分子生物检测是什么，酶—amp复合物再结合到具有5’磷酸基和3’---切口的dna上，使dna腺苷化；后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
dna重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过(牛碱性磷酸酶)cip处理克服。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性.但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即12-16℃，连接12-16h(过夜)，南京分子生物检测，这样既可大限度地发挥连接酶的活性，分子生物学检测报价，又---到短暂配对结构的稳定。
分子实验介绍——荧光检测
细胞荧光染色是以荧光物质标记而进行抗原定位的技术。在细胞中，通过特定的标记，可以检测目的蛋白表达量和表达定位。是细胞中的可直观观察细胞内蛋白定位和表达的实验方法。
实验流程：细胞固定-细胞膜破膜-蛋白封闭-目的蛋白结合-荧光二抗结合-dapi染色-荧光显微镜拍照或激光共---显微镜拍照。
结果示例：
细胞荧光染
通过观察细胞中蛋白的荧光强度和定位分析该蛋白的表达变化。
jia基化特---的pcr
herman 等（ 1996 ）在使用重---酸盐处理的基础上新建的一种方法。该方法敏感性高，主要用于作定性研究。用------盐处理基因组dna，所有未发生jia基化的胞嘧定被转化为尿嘧ding，而jia基化的胞嘧定不变；随后设计针对jia基化和非jia基化序列的引物进行pcr。通过电泳检测msp扩增产物，如果用针对处理后jia基化dna链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在jia基化；反之，说明被检测的位点不存在jia基化。
特点：适用范围广，分子生物学检测技术，能够检测特异位点是否发生jia基化。
------盐测序法（bisulfite sequencing pcr，bsp）
------盐修饰后测序法（ bsp ） frommer 等（ 1992 ）提出的研究 dna jia基化方法，此方法---性及jing确度高，能明确目的片段中每一个 cpg 位点的jia基化状态。用------盐处理基因组dna，所有未发生jia基化的胞嘧ding被转化为尿嘧ding，而jia基化的胞嘧ding不变。随后设计bsp引物进行pcr，在扩增过程中尿嘧定全部转化为胸腺嘧定，zui后对pcr产物进行测序就可以判断cpg位点是否发生jia基化，称为bsp-直接测序法。将pcr产物克long至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为bsp-ke隆测序法。
特点：jing确度高，能够准确检测出jia基化的程度百分比。
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