线粒体测序
线粒体是真核生物的重要细胞器,是生物体的能量工厂,参与能量代谢、信号转导、细胞凋亡等许多生命活动,对生物的生理活动起着---的作用。大部分线粒体基因由于其母系遗传特性以及进化速率较快等特点,被广泛地用于种群遗传学、进化生物学、谱系地理学和系统发育学、---诊断等学科领域。线粒体全基因组在生物进化的研究中具有---的优势。由于线粒体有着与真核生物长期共生的进化历史,因此其基因组包含了反映物种进化的关键信息,同时,相对于核基因组,线粒体基因组小,容易对大量物种进行横向的比较分析,有利于生物进化的研究,因而受到进化生物学家的---。线粒体的组成可以从两个层面上反映物种及群体的遗传和进化,即---序列组成和基因组的结构特征,两者的特征具有不同的进化机制和进化速度,在进化生物学研究中可以---的互补。
southern杂交
实验原理
southern印迹杂交(southern blot)是1975年由英---southern创建,是研究dna图谱的基本技术。southern印迹杂交是进行基因组dna特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经---性内切酶---的dnal片段,将胶上的dna变性并在原位将单链dnal片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上,经干烤或者紫外线照射固定,再与相对应结构的标记探针进行杂交,用放l射自显影或酶反应显色,从而检测特定dna分子的含量。
dna测序检测
1. pcr测序反应
(1)取0.2ml的pcr管,用记号笔编号,将管插在颗粒冰中,按下表加试剂:
所加试剂测定模板管标准对照管
bigdye mix
1μl
1μl
待测的质粒dna
1μ 1
pgem-3zf (+)双链dna
-1μ1
待测dna的正向引物
1μ 1
m13(-21)引物- 1μ 1
灭菌去离子水
2μ 1
2μ 1
总反应体积5μ 1,不加轻矿物油或石蜡油,盖紧pcr管,用手指弹管混匀,稍离心。
(2)将pcr管置于9600或2400型pcr仪.上进行扩增。98c变性2min后进行pcr循环,
pcr循环参数为96c 10s, 50c 5s, 60°c4min, 25 个循环,扩增结束后设置4c保温。
2.---法纯化pcr产物
(1) 将混合物离心,将扩增产物转移到1.5ml ep管中。
(2)加入25μ 1/---混合液,---分子检测,充分振荡,置冰上10min以沉淀dna。12 000r/min于
4c离心30 min,小分子检测,小心弃上清。
(3)加70%(v/v)的---50μ 1 洗涤沉淀2次。12 000r/min 于4c离心5min,小心弃上清和
管壁的液珠,生物分子检测,真空干燥沉淀10~ 15min。
3.电泳前测序pcr产物的处理。
(1)加入12μ 1的tsr于离心管中,剧烈振荡,让其充分溶解dna沉淀,稍离心。
(2)将溶液转移至盖体分离的0.2ml pcr管中,稍离心。
(3)在pcr仪上进行热变性(95c 2min),冰中骤冷,待_上机。
4..上机操作按仪器操作说明书安装毛细管,进行毛细管位置的校正,南京分子检测,人工手动灌胶和建立
运行的测序顺序文件。
5.仪器将自动进行序列分析,并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知,可通过
序列比较以星号标出差异碱基处,提高工作效率。
6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。
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