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分子与质粒载体构建

实验原理

外源dna与载体分子的连接就是dna重组，这样重新组合的dna叫做重组体或重组子。重组的dna分子是在dna连接酶的作用下，有mg2+、atp存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源dna分子进行连接。dna连接酶有两种：t4噬菌体dna连接酶和大肠dna连接酶。两种dna连接酶都有将两个带有相同粘性末端的dna分子连在一起的功能，分子生物检测，而且t4噬菌体dna连接酶还有—种大肠连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链dna分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高t4噬菌体dna连接酶浓度或增加dna浓度来提高平末端的连接效率。

t4噬菌体dna连接酶催化dna连接反应分为3步：，t4dna连接酶与辅助因子atp形成酶—amp复合物；然后，酶—amp复合物再结合到具有5’磷酸基和3’---切口的dna上，使dna腺苷化；后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。

dna重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过(牛碱性磷酸酶)cip处理克服。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性.但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即12-16℃，连接12-16h(过夜)，南京分子生物检测，这样既可大限度地发挥连接酶的活性，又---到短暂配对结构的稳定。

分子实验介绍——印迹（western blot）检测

通过sds-page凝胶将细胞或生物样品内的蛋白按照蛋白分子量从大到小规律分离开。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如纤维素薄膜或pvdf膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的起反应，再与酶或同位素标记的第二起反应（目前主要用hrp标记的第二），经过底物显色或自显影以检测电泳分离的特---目的基因表达的蛋白成分（目前主要使用鲁米诺和二---的hrp反应发出荧光，通过仪器或者胶片显色）。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验流程：细胞收集-细胞裂解，分子生物检测技术，蛋白提取-蛋白变性-sds-page电泳-蛋白质转膜印记-蛋白封闭-目的孵育-二抗孵育-显色拍照

结果示例：

图 a不同大小的质粒转染细胞后，western blot检测图片；b a蛋白不同培养时间后western blot检测图片；c 使用image pro plus软件对a蛋白灰度检测，a蛋白表达变化统计图