动物组织细胞基因组dna提取
操作步骤
1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，分子生物检测技术比较好，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶k
（500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，南京分子生物检测，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另
一离心管中。
2.加2倍体积异，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，小分子生物检测服务，用200ul te 重新溶解。（可进行pcr反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）
3.加等量的酚??振荡混匀，离心12000 rpm，5min。
4.取上层溶液至另一管，加入等体积的?，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。
5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/l氨加入2倍体积的无水---，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ，10min。
6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。
7.用1ml 70%---洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。
8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。
9.加200ul te重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?c20℃保存备用。
10.吸取适量样品于genequant上检测浓度和纯度。
聚合酶链式反应(pcr)
操作步骤
1.在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
1qpcr buffer
5 μl
dntp mix( 2mm )
4 μl
引物1(10pm)
μl 2
引物2 ( 10pm)
2μl
taq酶(2u/ul)
1 μl
dna模板( 50ng-1μg/μl )
1 μl
加ddh2o至
μl 50
视pcr仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置pcr仪上执行扩增。-般:在93°c
预变性3-5min ，进入循环扩增阶段: 93°c 40s***58°c 30s***72°c 60s ，循环30-35
次，分子生物检测试剂，后在72°c保温7min。
3.结束反应， pcr产物放置于4°c待电泳检测或-20°c长期保存。
4. pcr的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油，需用100ul进行抽提反应混合液，以
除去石蜡油;否则，直接取5- 10μl电泳检测。
分子实验介绍——荧光定量pcr检测
荧光定量pcr是检测生物样品中rna含量的普遍的方法，通过荧光染料或荧光标记的特---的探针，对pcr产物进行标记---，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。目前主要使用sybr green和taqman法对rna含量进行检测。sybr green在低样本量时成本较低，目前选用的较多。
sybr green i是一种只与dna双链结合的荧光染料。当它与dna双链结合时，发出荧光；从dna双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链dna分子的数量。sybr green荧光染料法定量pcr的基本过程是：1、开始反应，当sybr green染料与dna双链结合时发出荧光。2、dna变性时，sybr green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成pcr产物。4、聚合完成后，sybr green染料与双链产物结合，定量pcr系统检测到荧光的净增量加大。
实验流程：细胞或组织rna提取-rna浓度检测-rna逆转录-定量pcr检测。
结果示例：
图 a 基因扩增曲线图；b 基因扩增溶解曲线图；c mrna相对表达量变化
从图中可以扩增曲线可以看出目的rna扩增效果，溶解曲线可以看出引物识别特---情况，通过使用δδct方法计算可以得到每个组中目的mrna表达变化。
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