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小鼠成骨细胞和破骨细胞共培养模型的建立

细胞之间的相互调控作用奠定基础.方法利用24 h内新生小鼠颅骨和4~8周龄成年小鼠四肢长分别分离、培养成骨细胞和破骨细胞，采用间接接触的培养模式将接种了骨sui单核细胞的玻片或骨片置入提前24 h接种了成骨细胞的培养皿中进行共培养.共培养-定时间后进行破 骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，trap染色鉴定和骨吸收功能检测，并进一 步采用rt- pcr对破骨细胞标志酶基因基质金属蛋白酶.9(mmp-9)、trap 和组织蛋白酶k (cathepsin k )的表达进行检测结果共培养5天后---trap(+)多核细胞形成13天trap(+ )多核细胞数目达到高峰;骨吸收陷窝在共培养7天后开始出现，随着培养时间的延长，陷窝面积呈增加趋势;破骨细胞标志基因trap在共培养3天时开始表达，而mmp-9和cathepsin k则在共培养5天后表达结论共培养体系中成骨细胞对破骨细胞调控作用------的破骨细胞具有噬骨能力，该共培养模型可用于成骨细胞和破骨细胞之间的相互调控作用研究.

平板克l隆形成实验基本步骤::

1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰 蛋白酶---并吹打成单个细胞，cck8检测费用，并把细胞悬浮在10%胎牛的dmem培养液中备用。

2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200 个细胞的梯度密度分别接种含10ml 37预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37团5% co2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2~3周。

3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的时，终止培养。弃去上清液，用pbs小心浸洗2次。加4%---固定细胞5ml固定15分钟。然后去固定液，加适量gimsa应用染色液染10~30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的数。后计算形成率。形成率= (数/接种细胞数) x100%平板形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。平板形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞- -定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。