南京细胞粘附检测-英瀚斯

三、自噬过程进行观察和检测

1、观察自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。phagophore的特征为:新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(av1 )的特征为:双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(av2 )的特征为:单层膜，胞浆成分己降解。( autophagic vacuolo av )

2、在荧光显微镜下采用gfp-lc3融合蛋 白来示踪自噬形成由于电镜耗时长，不利于监测(monitoring) 自噬形成，人们利用lc3在自噬形成过程中发生---的现象开发出了此技术。无自噬时，gfp-lc3融合蛋 白弥散在胞浆中;自噬形成时，gfp-lc3融合蛋白转 位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

3、利用western blot检测lc3-ii/比值的变化以评价自噬形成自噬形成时，胞浆型lc3 (即 lc3-i)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即lc3-id，因此，lc3-ii/比值 的大小可估计自噬水平的高低。(注意: lc3对lc3-ii有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。)

4、mdc (monodansylcadaverine ，单丹---尸胺)染色:包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特---的。

5、celltrackertm green染色:主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特---的。

细胞实验介绍——细胞运动能力检测：

细胞划痕实验是体---拟细胞迁移能力和修复能力快捷的检测方法。在长满的细胞培养板或者培养皿中，沿着中线使用移液器枪头或者其他硬物划1-3条平行的直线，去除中线的细胞，细胞在0h、12h、24h后，主动脉血管内皮细胞分离培养，观察细胞往中线迁移情况，判断细胞迁移能力。

一般流程：细胞接种培养-划痕-不同时间点拍照

细胞迁移和侵袭实验是体---拟细胞迁移和侵袭能力的检测方法。使用不同孔径的聚---膜transwell小室放入培养板中，将细胞接种于小室中，利用培养液成分的差异---细胞运动，检测细胞的迁移和侵袭能力的差异。

一般流程：transwell小室准备-细胞接种-细胞培养-transwell小室染色-显微镜拍照

结果示例：

                                       图 a 细胞划痕实验图；b，c 细胞迁移和侵袭实验图