英瀚斯-南京成纤维细胞分离培养实验

 细胞elispot检测    

  1．培养板的预处理：在24孔培养板内加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，弃掉板中的处理液，用pbs洗涤3次，每次3min；

     2．抗原包被：将适量抗原溶于包被缓冲液中，每孔加入0.5ml，4℃过夜，pbs-t洗涤3次，每次3min；

     3．制备细胞悬液：将待测已致敏小鼠处死，取出pi脏，置于加有hanks液的平皿内，用钝头直角9号zhu射器针头破少许脾被膜后，赶出细胞，用毛细吸管轻轻吹散细胞团后，将悬液通过250目尼龙网，取滤液，1000r/min离心5min，hanks液洗涤3次，计数细胞后，用1640液重新悬浮细胞，配成所需浓度；

     4．往各孔中加入0.5ml含不同浓度（104-106/ml）的细胞悬液，置37℃，5％co2条件下孵育2-4h，弃掉培养液，pbs-t洗涤3次，每次3min；

     5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（bio-ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃过夜，弃掉液体，pbs-t洗涤3次，每次3min；

     6．加入辣根---化物酶结合的亲合素（avi-hrp）（2μg/ml），37℃孵育30min，弃掉液体，pbs-t洗涤3次，每次3min；

     7．配制明胶-底物液：在37℃水浴中，将2.5mltmb溶液（4mg/ml  jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明胶溶液（用ph5.0磷酸钠-柠檬酸缓冲液配制）边加边搅，溶液呈白色，加入14μl 3% h202；

     8．显色与计数：将培养板底冰浴，每孔加入0.6ml明胶-底物液，约3min，混合液凝固，将培养板取出，置室温5min，将板倒置，用肉眼和低倍放大镜计数所显示出的颜色的斑点。

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---是指同一来源的细胞逐渐产生出形态结构、功能特征各不相同的细胞类群的过程，其结果是在空间上细胞产生差异，在时间上同一细胞与其从前的状态有所不同。---的本质是基因组在时间和空间上的选择性表达，通过不同基因表达的开启或关闭，终产生---蛋白质。细胞---是指将一群不同类型或者形态结构、功能特征存在差异的细胞通过生物学、物理学等手段，将之转变为具有相似/相同形态结构、功能特征的细胞群体的过程。