聚合酶链式反应(pcr)
操作步骤
1.在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
1qpcr buffer
5 μl
dntp mix( 2mm )
4 μl
引物1(10pm)
μl 2
引物2 ( 10pm)
2μl
taq酶(2u/ul)
1 μl
dna模板( 50ng-1μg/μl )
1 μl
加ddh2o至
μl 50
视pcr仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置pcr仪上执行扩增。-般:在93°c
预变性3-5min ，进入循环扩增阶段: 93°c 40s***58°c 30s***72°c 60s ，循环30-35
次，后在72°c保温7min。
3.结束反应， pcr产物放置于4°c待电泳检测或-20°c长期保存。
4. pcr的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油，需用100ul进行抽提反应混合液，荧光定量pcr检测，以
除去石蜡油;否则，直接取5- 10μl电泳检测。
腺---包装原理介绍
腺---是一种没有包膜的直径为79-90nm的颗粒，由252个 壳粒呈二十面体排列构成。每个壳粒的直径为7-9nm。衣壳里是线状双链dna分子，两端各有长约100bp的反向重复序列。人体腺--- 已知有33种，分别命名为ad1-ad33，研究详细得是ad2.
腺---是一种无包膜的球型结构的---，遗传物质为线型 双股dna形式。腺---的特点：（1）gan染范围广对人致病性低；（2）对增殖和非增殖细胞均具有gan染性；（3）能有效进行增殖；（ 4）---滴度高；（5）不整合到染色体中，rnapull-down检测，无插入致突变性；(6)外源基因装载容量大。由于腺---的这些特点使其广泛地应用于体 外基因转导、体内接种yi苗、和基因zhi疗等各个领域。
实验方法
1.获得目的基因序列；
2.构建---表达载体质粒；
3.表达载体质粒和包装质粒重组；
4.gan染hek293，包装出---；
5.---扩增、浓缩；
6.滴度测定。
基因组甲l基化水平(methyl ati on content)的分析:
1.高l效液相色谱(hi gh-performanceli qui dchromatography， hplc)hplc是- -种比较传统的方法，雅安检测，是根据dna或蛋白分子量和构象的不同而使其加以分离。由于在动态相和静态相下分子的光吸收度并不相同而加以定量。随着系统的压强的增加，其分辨率增l高。故而能够定量测定基因组整体水平dna甲l基化水平。该方法由ruo等1980年首l次---。过程是将dna样品先经---或氢l氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，mirna合成，结果与标准品比较，用紫外光测定吸收峰值及其量，计算5 mc/(5mc+5c)的积分面积就得到基因组整体的甲l基化水平。这是一种检测dna甲l基化水平的标准方法。
2.高l效毛细管电泳法(hi gh-per formance capillary electrophoresis， hpce)这是一-种利用窄孔熔融石英毛细管来从复合物中分离不同化学组分的技术。其基础是在强电场下不同分子的由于其所带电荷，大小，结构以及疏水性等不同而相互分开。用hipce方法处理dna水解产物来确定5mc水平，简便，经济且敏感性高。
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