软gu细胞培养
(1)---脱颈处死，备皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮肤。
(2)无菌操作下取下双侧股骨头及膝关节(保留周围肌肉，软gu不能暴露)，75%酒精浸泡5分钟，293t细胞，转移至pbs缓冲液中，带入超净工作台，剔除关节周围附着的软组织，打开髋、膝关节，用尖刀削取关节软gu组织，置入装有pbs缓冲液的无菌培养皿，防止软gu组织被风干。
(3)pbs缓冲液充分漂洗软gu小块3次，然后用小剪刀将软gu块切碎至约imm3大小。
(4)再次用pbs缓冲液冲洗3次，滤干，将细小的软gu块置入放有0.2%的ii型胶原酶3ml的广口瓶里，摇匀后置于37°c恒温震荡箱中---，单细胞测序，40分钟后将上层---液转移至15ml规格离心管中，800r/min离心5min，收集细胞(沉淀物)，加入含10%的胎牛xue清dmem培养液4ml并吹打混匀，制成软gu细胞混悬液。
(5)把---所得的软gu细胞混悬液收集于离心管中，经滤网过滤后用细胞计数板计数，并把细胞混悬液密度调整为2x105/ml接种于25cm2规格的培养瓶中。将培养瓶放置于co2培养箱内。培养条件为37°c、5%co2。
(6)未---完的软gu小块继续用ii型胶原酶如_上法---，直至软gu块基本消失。
(7)每日在倒置显微镜下观察软gu细胞生长情况并拍照保存。
细胞实验介绍——慢---建立稳转细胞系
慢---包装：公司使用3质粒慢---包装系统，慢---系统使用plko.1-egfp、pspax2、pmd2.g，细胞实验外包，过表达慢---系统使用plvx-acgfp、pspax2、pmd2.g三质粒系统，将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法转染至hek293t细胞中，培养48h后，收集上清。使用genecopo公司慢---颗粒纯化试剂盒将慢---纯化。纯化后留取部分检测---滴度，其余---冻存于-80℃冰箱中。
滴度检测：将---颗粒使用梯度稀释，分别293t细胞，72h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算---滴度。
细胞：在---前---对细胞进行计数，接种约10000个细胞于12孔板中，培养过夜后使用无培养基稀释---，加入12孔板中对细胞进行，---数量根据细胞的moi加入（若无moi，需做---梯度：1，5，10，50，100 5个梯度对细胞），6h后去除含---溶液，加入完全培养基细胞培养，培养48h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。同时加入puromycin对细胞筛选，筛选约2周时间。细胞筛选好后，使用定量pcr和western blot检测目的基因的稳定表达情况。
实验流程：慢---质粒构建-hek293t细胞培养-质粒转染293t细胞----收集----纯化----滴度检测-细胞-稳转细胞筛选-稳转细胞鉴定
结果示例：
图 a ---滴度检测；b 目的细胞---效果图
细胞生物学服务
南京英瀚斯生物科技公司自建有标准的细胞培养房，德阳细胞，配备有生物安全柜、超净工作台、细胞三气培养箱、---细胞培养箱、荧光倒置显微镜、体视镜、、流式细胞仪等设备。细胞组---毕业于东南大学、华中科技大学等高校生物学相关，具有硕士研究生以上---，熟练掌握细胞学相关实验，可开展多种细胞实验。
细胞实验外包-德阳细胞-英瀚斯生物科技由南京英瀚斯生物科技有限公司提供。南京英瀚斯生物科技有限公司有实力，---，在江苏 南京 的技术合作等行业积累了大批忠诚的客户。公司精益---的工作态度和不断的完善---理念将促进英瀚斯和您携手步入，共创美好未来！
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