293t细胞-细胞-英瀚斯生物科技公司

 细胞elispot检测    

  1．培养板的预处理：在24孔培养板内加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，弃掉板中的处理液，用pbs洗涤3次，每次3min；

     2．抗原包被：将适量抗原溶于包被缓冲液中，每孔加入0.5ml，4℃过夜，pbs-t洗涤3次，每次3min；

     3．制备细胞悬液：将待测已致敏小鼠处死，取出pi脏，细胞培养技术，置于加有hanks液的平皿内，用钝头直角9号zhu射器针头破少许脾被膜后，赶出细胞，用毛细吸管轻轻吹散细胞团后，将悬液通过250目尼龙网，取滤液，单细胞测序，1000r/min离心5min，hanks液洗涤3次，计数细胞后，用1640液重新悬浮细胞，配成所需浓度；

     4．往各孔中加入0.5ml含不同浓度（104-106/ml）的细胞悬液，置37℃，5％co2条件下孵育2-4h，弃掉培养液，pbs-t洗涤3次，每次3min；

     5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（bio-ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃过夜，弃掉液体，pbs-t洗涤3次，每次3min；

     6．加入辣根---化物酶结合的亲合素（avi-hrp）（2μg/ml），37℃孵育30min，弃掉液体，pbs-t洗涤3次，每次3min；

     7．配制明胶-底物液：在37℃水浴中，将2.5mltmb溶液（4mg/ml  jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明胶溶液（用ph5.0磷酸钠-柠檬酸缓冲液配制）边加边搅，溶液呈白色，加入14μl 3% h202；

     8．显色与计数：将培养板底冰浴，293t细胞，每孔加入0.6ml明胶-底物液，约3min，混合液凝固，将培养板取出，置室温5min，将板倒置，用肉眼和低倍放大镜计数所显示出的颜色的斑点。