聚合酶链式反应(pcr)
操作步骤
1.在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
1qpcr buffer
5 μl
dntp mix( 2mm )
4 μl
引物1(10pm)
μl 2
引物2 ( 10pm)
2μl
taq酶(2u/ul)
1 μl
dna模板( 50ng-1μg/μl )
1 μl
加ddh2o至
μl 50
视pcr仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置pcr仪上执行扩增。-般:在93°c
预变性3-5min ，进入循环扩增阶段: 93°c 40s***58°c 30s***72°c 60s ，循环30-35
次，后在72°c保温7min。
3.结束反应， pcr产物放置于4°c待电泳检测或-20°c长期保存。
4. pcr的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油，需用100ul进行抽提反应混合液，以
除去石蜡油;否则，---怎么做，直接取5- 10μl电泳检测。
蛋白质双向电泳实验流程
1.---yi酸-bing酮沉淀法提取蛋白
2.双向电泳分离待测样品
(1)一相等电---前处理按照所用仪器的厂商提供操作手册进行。蛋白质上样浓度不要超过10mg/ml，否则会造成蛋白质的---或沉淀。
(2)等电---完毕后(约需24hr），pcr实验室，若不立即进行第二相电泳，绵阳pcr，胶条可夹在两层塑料薄膜中于-70℃保存数月。
(3)等电---好的胶条按厂商提供的操作手册平衡两次。平衡完毕后，于电泳仪上用12.5%sds-page凝胶进行电泳分离。仪器设置为2.5w/胶 45min，15w/胶 5-8hr，pcr，20℃。
3.银染法对凝胶进行染色
(1)固定(2)清洗(3)增敏(4)清洗(5)染色(6)清洗(7)显影(8)定影(9)水洗
3.凝胶扫描及图像分析
(1)图像扫描：凝胶染色后采用image scanner以300dpi，16-bit模式（65536灰阶）进行扫描。
(2)图像分析：扫描完毕后，凝胶继续置于1%yi酸中于4℃保存。扫描后的图像用imagemaster 2d platinum software软件进行分析。分析按照软件厂商提供的说明书进行。以zui小点面积30，平滑度2为主要参数zui大限度检测蛋白质点。以目标蛋白质3个重复具有相同趋势，目标蛋白质相邻位点的相对一致性，至少2个重复有2倍以上差异作为判定差异表达蛋白质的标准。
rna提取
1.弃去培养液，用pbs清洗两次1-2。
2.弃去pbs，用1000u1枪吸干净残余pbs。
3.加1ml trizol研磨b 41。
4. 1.5miep管标号与每孔相对应备用。
5.研磨好的溶液转移至对应的 ep管。
6.往每个ep管中加入250ul，剧烈震荡30s， 冰上静置12min[问l。
7. 所有样品4c离心，转速: 13500转1分钟，时间: 15min.
8. 再次标记一批同样编号ep管。
9.离心后吸上清液400u1移入相应编号的ep管中，再加入400ul异充
分混匀。4c冰箱35min。
10. 4c离心，转速: 13500转1分钟，时间: 10min.
11.弃去.上清液，加1m175%---，轻摇7]。
12. 4c离心，10600转/分钟，时间: 5min.
13. 弃上清液滤纸吸干。
14. 加depc水10ul溶解，-80c保存。进行逆转录前测浓度。
组织rna提取
1、剪米粒大小组织块放入ep管中标号。
2、ep管中加300ul trizol浸泡30分钟或更久。
3、用研磨棒研磨，以肉眼很难看到组织为宜。
4、加700u1 trizol静 置5分钟。
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