25.pcr扩增不出就引物有问题吗？
答：基本不是。当今发展出各色各样的pcr扩增技术，各色各样的高温聚合酶，就是来解决pcr扩增中遇到的扩不出、扩增效率低的问题。如巢式pcr就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。 有些重复片段的扩增，---多少钱， gc含量高的片段，非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。
引物扩增不出，主要是下列两种情况比较常见：
（1） rt-pcr。请注意，很多基因通过常规rt -pcr方法是很难扩增出来的。 rt- pcr成功的关键在于rt的反应的rna和目标基因在特定组织和细胞中含量。
（2）从基因组中扩增。一般情况下，基因在基因组中都是单拷贝，基因组作为模板需要严格控制用量。基因组dna过高，会影响反应体系中的mg和ph
2.引物纯化方式有哪些，如何选择？
◆ 脱盐
寡核苷酸合成后，为了纯化寡核苷酸成为天然的dna结构，首先必须去除保护基团。通过浓---处理，合成的寡核苷酸从固相载体---离，2-乙-----磷酸二脂键的保护基团，以及碱基的保护基团基（------基和异丁基）被去除，从而形成了天然的dna结构。然而，---的去保护步骤完成后，寡核苷酸混合物还包含几种必须被去除的小分子有机化合物。所有非必须有机化合物被移除的过程通常叫做脱盐。脱盐纯化可以借助反向硅胶柱进行。尽管脱盐纯化可以移除所有的非必须有机杂质，但它不能有效移除合成中产生微量的提前终止的寡核苷酸杂链。然而，脱盐的寡核苷酸还是能够满足ｐｃｒ检测等基础生物研究。
◆ biorp / opc纯化
如果寡核苷酸以“三---”的形式合成，则n-寡核苷酸包含5’-dmt基团，提前终止的寡核苷酸不包含该基团。因为dmt基有强的亲脂的特性，有5’-dmt基团的寡核苷酸与反相树脂有亲和性，因此反相亲和树脂通常被用于寡核苷酸的纯化。利用反向树脂和5’－dmt寡核苷酸存在强亲和力，但是提前终止的寡核苷酸不包含dmt基团，所以，我们能够成功的把想要的n-寡核苷酸从提前终止的寡核苷酸杂质中分离出来。
15.测序发现引物有突变是怎么回事？
答：测序发现引物区域有突变，---是40个碱基以下的引物， 发生的概率不大，但是肯定也会发生。用户一般可以放心，引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列copy到合成仪的，碱基输错的机会不多。---合成公司一般会有一套控制办法，预防碱基输入错误。发生这种突变的原因有很多解释，人们还没有办法解决这个问题。引物合成的固相合成原理都一样，采用的机器也基本相同，合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的，所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似，没有人可以超脱。
引物合成是一种多步骤的化学反应，合成也就是99%，副产品不可以避免。引物序列中插入突变往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分单体发生丢失dmt，导致单体又接了上去，故发生插入同一碱基的突变。至于缺失突变，一般认为是一般认为是带帽(capping)反应不造成的，caping反应主要是封闭数5′----没有参加反应单体。---闭的引物，在下一轮偶连时将不能继续参与合成。对于碱基置换的突变，产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，引物的这些区域不能---地与互补链配对，当扩增的产品被亚转化到大肠中，可能被---中修复系统补上了非配对的碱基。置换突变通常发生在g 转换成其它碱基。碱基g在一定条件下可以转化为烯醇异构体 （脱呤），2，6 diaminopurine ， dna和扩增过程中dna聚合酶将2，6 diaminopurine看作碱基a，pcr引物设计，测序就会发现碱基g-a置换。脱呤现象在富含呤的引物中发生的频率较高。脱呤的引物在引物后处理脱保护阶段如果被降解，宜宾pcr，测序就会发现碱基g或a的缺失。
引物合成过程中，pcr检测，造成碱基插入，缺失，置换突变的因素客观存在，有不少降低发生的频率建议和措施，但是这些措施还停留在实验室阶段，还没有能够应用到规模化生产中。
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