分子实验介绍——印迹(western blot)检测
通过sds-page凝胶将细胞或生物样品内的蛋白按照蛋白分子量从大到小规律分离开。经过page分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如纤维素薄膜或pvdf膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,杭州pcr,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的起反应,再与酶或同位素标记的第二起反应(目前主要用hrp标记的第二),经过底物显色或自显影以检测电泳分离的特---目的基因表达的蛋白成分(目前主要使用鲁米诺和二---的hrp反应发出荧光,pcr检测,通过仪器或者胶片显色)。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验流程:细胞收集-细胞裂解,蛋白提取-蛋白变性-sds-page电泳-蛋白质转膜印记-蛋白封闭-目的孵育-二抗孵育-显色拍照
结果示例:
图 a不同大小的质粒转染细胞后,western blot检测图片;b a蛋白不同培养时间后western blot检测图片;c 使用image pro plus软件对a蛋白灰度检测,a蛋白表达变化统计图
免yi共沉淀(co-ip检测)是以抗ti和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的方法。当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质与蛋白质间的相互作用也被保留下来。用预先固化在beads上的蛋白质a的抗ti免yi沉淀a蛋白,pcr引物设计,那么与a蛋白在体内结合的蛋白质b也能一起沉淀下来,再通过蛋白变性分离,对b蛋白进行检测,进而证明两者间的相互作用。
str检测
短串联重复(short tandem repeats, str),又称微wei星dna(microsatellite dna)或简单重复序列(--- repeat sequence, srs或ssr),fish检测,是广泛存在于原核生物和真核生物基因组中的核苷酸重复序列。有丝分裂过程中dna链之间的错配引起的fu制滑动被认为是导致str产生的较为常见原因,并且依据不同fu制单元大小的不同以及不同物种之间,fu制滑动发生的概率也不相同。
str是以序列 (core repeat units) 首尾相连多次重复形成。每个str的序列结构相同,长度为2-6bp,但其重复单位数目和重复区域的长度不同,因此str在不同种族、不同人群之间的分布具有差---,构成了str遗传多态性。不同个体之间在一个同源str位点的重复次数也不同,因而同指纹识别一样,str位点分析也可对个体进行身份识别。通过识别个体基因组在特定位点的特定序列重复,即可创建其基因档案。基于此,str分析法已经成为一种重要的鉴定分析方法,应用于---学、qin子鉴定及细胞鉴定等领域。
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