逆转录---构建及包装
逆转录---（retrovirus）是一类rna---。在逆转录酶的作用下，以---rna为模板合成cdna再通过dna、转录、翻译等过程形成---颗粒。逆转录---表达系统是一种新的重组蛋白表达系统，由逆转录---载体、辅助载体（表达---包装需要的蛋白质）和包装细胞系组成。逆转录---载体在外源基因表达、基因沉默、、生物制药等得到广泛的应用。逆转录---载体主要优点：转染范围广，可以各种细胞类型，实时定量pcr，转入的外源基因可完全融合，对细胞率高，细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源基因。
逆转录---载体系统共有两部分组成：包装细胞系和缺陷---本身。在逆转录---载体中，去除了正常的蛋白编码序列而保留了和包装信号，通过分子技术将目的基因插入此载体上，而包装细胞系能提供---载体包装成---粒子所需的结构蛋白。当重组---载体导入包装细胞后，缺陷---载体和包装细胞的互补作用共同完成---装配，该---颗粒可其它宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，pcr，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。宿主细胞不能像包装细胞那样为缺失结构基因的逆转录---提供结构蛋白，因而在宿主细胞内不会产生新的毒颗粒，---了该载体在生物制品领域的生物安全性问题。
2.引物纯化方式有哪些，如何选择？
◆ 脱盐
寡核苷酸合成后，为了纯化寡核苷酸成为天然的dna结构，首先必须去除保护基团。通过浓---处理，合成的寡核苷酸从固相载体---离，2-乙-----磷酸二脂键的保护基团，以及碱基的保护基团基（------基和异丁基）被去除，pcr引物设计，从而形成了天然的dna结构。然而，---的去保护步骤完成后，寡核苷酸混合物还包含几种必须被去除的小分子有机化合物。所有非必须有机化合物被移除的过程通常叫做脱盐。脱盐纯化可以借助反向硅胶柱进行。尽管脱盐纯化可以移除所有的非必须有机杂质，但它不能有效移除合成中产生微量的提前终止的寡核苷酸杂链。然而，脱盐的寡核苷酸还是能够满足ｐｃｒ检测等基础生物研究。
◆ biorp / opc纯化
如果寡核苷酸以“三---”的形式合成，则n-寡核苷酸包含5’-dmt基团，提前终止的寡核苷酸不包含该基团。因为dmt基有强的亲脂的特性，有5’-dmt基团的寡核苷酸与反相树脂有亲和性，因此反相亲和树脂通常被用于寡核苷酸的纯化。利用反向树脂和5’－dmt寡核苷酸存在强亲和力，但是提前终止的寡核苷酸不包含dmt基团，所以，pcr实验室，我们能够成功的把想要的n-寡核苷酸从提前终止的寡核苷酸杂质中分离出来。
二、操作步骤：
1. 所有在纯化系统里使用的溶液当日都需要经过 0.22μm 的滤膜抽滤、脱气处理；保存 4℃ 冰箱里的缓冲液若要在室温使用需恢复至室温后抽滤脱气；
2. 样品上柱纯化前，需先滤膜过滤，少量样品可用离心（13000rpm，10min）；
3. 依次用水、缓冲液洗泵；设置流速和柱前警报压（压力值参阅层析柱及填料说明书，取较小的一个大耐受压力）。防止柱中进入气泡，影响分离效果；
4. 当柱子限压在 0.3mpa，或者在限压状态---速很低时，ph valve 中的 restirtor 可以切换成 off line，即显示 by-pass 状态；
5. 当需要通过仪器上样环上样时，将 w1 阀口处换成带透明短软管的阀门，从此处阀门位通过倒吸样品上样；
6. 进样阀「inject」为上样状态。上样结束可将进样阀切换回「load」状态。并用纯水认真清洗上样环至少 3 次；将 w1 阀口处换回原来接头阀门。
7. 纯化结束后，用纯水清洗泵和平衡柱子；再用 20% 的---清洗泵以及系统。长期不用，层析柱应保存在 20% 的---中，泵放置在 20% ---中；
8. 实验结束后及时倾倒废液瓶里的废液；
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