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    2023-3-23

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蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛,是一项重要的操作技术。 一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质,一些含量十分丰富,一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质,必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。


一、主要方法

1. 蛋白质的选择吸附分离(利用颗粒不同程度的颗粒吸附力来使分离的目的达到)。

2. 按照配体特性的分离-亲和层析(利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异结合这一生物性质)。

3. 低温沉淀法,使用如,---等与水可混溶的,降低多数蛋白质的溶解度并且将其析出,和盐析相比较,---,这种方法的分辨率的高,然而蛋白质比较容易变形,需要在低温下进行。

4. 按照分子大小不一样的方法,密度梯度离心(在介质中对蛋白质离心时,蛋白质沉降速度取决于它的和密度,和密度越大,那么沉降越快;凝胶过滤(一种柱层析);超过滤(利用蛋白质分子不能从半透膜通过的性质)。

5. 按照溶解度差异分离,等电点沉淀法盐溶与盐析(使用一定浓度盐溶液来使蛋白质的溶解度增大或减小);(因为在等电点时蛋白质分子的净电荷为 0,使分子间静电斥力减少了,所以,---沉淀比较容易,这时具有小的溶解度)。

6. 按照电荷不同的分离方法。主要分为离子交换层析和电泳分离。






microrna芯片:

rna干扰(rna interference, rnai)现象是一种进化上保守的抵御或外来---qin犯的防御机制。将含有靶基因mrna同源互补序列的rna(double strand rna, dsrna)导入细胞后,能够特异地识别该mrna,引起mrna的降解,---怎么做,从而导致相应的功能缺失。rnai提供了一种经济、快捷、gao效的抑制特异基因表达的技术手段,该技术已被广泛用于研究基因功能和chuan染性---及恶xingzhong瘤基因zhi疗领域。目前常用的rna干扰手段为mirna、 shrna和sirna等。

mirna是一类可以通过rnai机制调节基因表达的内源性小rna,人工mirna与shrna的设计原理基本相同,由于mirna具有内源性,因此其更易产生有效的基因沉默。

技术流程:

dsrna或pre-mirna被导入细胞后,能够被一种特异的---内切酶(dicer)识别并切割成为小片段,这些片段在rna解旋酶的作用下解链。继之反义链在与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成rna---的沉默复合物(rna-induced silencing complex,risc),risc与mrna同源区进行特---结合,乐山pcr,若mirna与mrna的结合位点配对,pcr实验室,则切割mrna;若mirna与mrna的结合位点不配对,则抑制mrna的翻译。








rip

技术概述

rip是研究体内蛋白与rna互作的重要技术。该技术先用甲醛等试剂交联细胞内的“蛋白-rna”互作复合物,裂解细胞后,用靶蛋白特异的抗l体(或标签抗l体)做免l疫沉淀,获得“靶蛋白-rna”互作复合物,去交联分离其中的rna;针对预测的靶蛋白结合rna的序列设计引物,

做qpcr实验,验证预测的rna是否与靶蛋白有结合,或者将分离出来的rna做高通量测序,筛选到可能与靶蛋白结合的rna。

技术流程


细胞交联-***细胞裂解-***免l疫共沉淀***去交联***rna分离***建库***高通量测序(或qpcr)。









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