蛋白质双向电泳实验流程
1.---yi酸-bing酮沉淀法提取蛋白
2.双向电泳分离待测样品
(1)一相等电---前处理按照所用仪器的厂商提供操作手册进行。蛋白质上样浓度不要超过10mg/ml，甘孜pcr，否则会造成蛋白质的---或沉淀。
(2)等电---完毕后(约需24hr），若不立即进行第二相电泳，胶条可夹在两层塑料薄膜中于-70℃保存数月。
(3)等电---好的胶条按厂商提供的操作手册平衡两次。平衡完毕后，于电泳仪上用12.5%sds-page凝胶进行电泳分离。仪器设置为2.5w/胶 45min，15w/胶 5-8hr，20℃。
3.银染法对凝胶进行染色
(1)固定(2)清洗(3)增敏(4)清洗(5)染色(6)清洗(7)显影(8)定影(9)水洗
3.凝胶扫描及图像分析
(1)图像扫描：凝胶染色后采用image scanner以300dpi，16-bit模式（65536灰阶）进行扫描。
(2)图像分析：扫描完毕后，凝胶继续置于1%yi酸中于4℃保存。扫描后的图像用imagemaster 2d platinum software软件进行分析。分析按照软件厂商提供的说明书进行。以zui小点面积30，pcr引物设计，平滑度2为主要参数zui大限度检测蛋白质点。以目标蛋白质3个重复具有相同趋势，目标蛋白质相邻位点的相对一致性，至少2个重复有2倍以上差异作为判定差异表达蛋白质的标准。
通常活性氧阳性对照在---细胞20-30分钟后可以---提高活性氧水平。
收集细胞后装载探针：按照1：1000用无培养液稀释dcfh-da，使终浓度为10微摩尔/升。细胞收集后悬浮于稀释好的dcfh-da中，细胞浓度为一百万至二千万/毫升，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的dcfh-da。直接用活性氧阳性对照及自己感兴趣的---细胞，或把细胞等分成若干份后---细胞。通常活性氧阳性对照在---细胞20-30分钟后可以---提高活性氧水平。
2.、检测
对于原位装载探针的样品可以用激光共---显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光或流式细胞仪检测。
对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光或流式细胞仪检测，用激光共---显微镜直接观察也可以。
常规碱基分子量：
11.如何溶解引物？
答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mm tris ph7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的ph值比较低（ph4-5），引物在这种条件下不稳定。
12.如何保存引物？
答：引物合成后，---多少钱，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高，合成的od数较大，建议分装，避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。
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