单细胞测序(英语:single cell sequencing)采取优化的下一代dna测序技术(ngs)检测单细胞的序列,可以获得特定微环境下的细胞序列差异以方便研究其功能差异等。对个体细胞的dna测序可以帮助我们了解例如在中的小范围细胞的变异;对其进行rna测序可以帮助我们了解和鉴别不同的细胞类型与其表现的基因,对研究发育生物学等有较大裨益。
分离单细胞
在全基因组扩增和测序前,有很多方法可以分离细胞个体,其中流式细胞术(facs)较为常用。个体细胞可以用显微操作来收集,这样较为快捷而且成本较低,但是比较有技术难度,而且显微镜下对细胞的错误分类容易影响实验结果。激光捕获显微切割技术(lcm)亦可以用来收集单细胞。但是尽管激光捕获显微切割可以保留样本细胞在组织中的空间位置,但是捕获单细胞的时候容易连带周围细胞的物质。高通量的细胞个体分离还可以使用微流控技术。微流控技术和流式细胞技术都能准确而自动地分离无偏样本。但是,两种方法都要求首先将细胞从其为环境中脱离,pcr引物设计,因此可能在rna表达分析中造成对转录数据的干扰。
rna提取处理的步骤如下:
在玻璃烧杯中注入去离子水,pcr,加入depc使其终浓度为0.05%~0.1%(depc-h2o)。(depc二焦---为活性很强的物,须在通风橱中小心使用)
将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入depc-h2o,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中,在通风柜中37℃ 或室温下处理过夜。
将depc-h2o小心倒入废液瓶中,将装有depc- h2o 处理过的塑料制品的容器以铝箔封口,高温高压蒸汽灭菌至少30分钟。
灭菌塑料制品烘烤干燥,pcr实验室,置洁净处备用。
玻璃和金属物品250 ℃烘烤3小时以上。
25.pcr扩增不出就引物有问题吗?
答:基本不是。当今发展出各色各样的pcr扩增技术,各色各样的高温聚合酶,就是来解决pcr扩增中遇到的扩不出、扩增效率低的问题。如巢式pcr就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。 有些重复片段的扩增, gc含量高的片段,非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。
引物扩增不出,主要是下列两种情况比较常见:
(1) rt-pcr。请注意,很多基因通过常规rt -pcr方法是很难扩增出来的。 rt- pcr成功的关键在于rt的反应的rna和目标基因在特定组织和细胞中含量。
(2)从基因组中扩增。一般情况下,pcr,基因在基因组中都是单拷贝,基因组作为模板需要严格控制用量。基因组dna过高,会影响反应体系中的mg和ph
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