◆ hplc
如果合成的寡核苷酸应用于,定向诱变或定量的基因探测,那么对其纯度要求较高。脱盐或opc纯化的寡核苷酸可能达不到要求,则hplc纯化被广泛地用于这个目的。作为一种纯化树脂,阴离子交换树脂或反向树脂被用于寡核苷酸纯化。阴离子交换树脂的hplc通常显示95-98%纯化效率,pcr实验室,对于达到35-mer寡核苷酸的纯化是充分的。反向树脂化的hplc与阴离子交换树脂的hplc呈现相似的纯化效率。因为hplc的纯化效率很大程度依靠寡核苷酸的长度,用hplc法不能有效纯化长的寡核苷酸(大于35-mer)。
◆ page
对于长的寡核苷酸的纯化(50-100mer),我们page纯化法,荧光定量pcr,它使用交连的聚---凝胶(电泳)作为纯化基质。尽管page显示出高的纯化效率(>98%),但它在额外的步骤方面有一些缺陷,比如在page之后需要提取和脱盐,继而将导致纯化产率的下降。
免yi共沉淀(co-ip检测)是以抗ti和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的方法。当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质与蛋白质间的相互作用也被保留下来。用预先固化在beads上的蛋白质a的抗ti免yi沉淀a蛋白,那么与a蛋白在体内结合的蛋白质b也能一起沉淀下来,再通过蛋白变性分离,对b蛋白进行检测,进而证明两者间的相互作用。
microrna芯片:
rna干扰(rna interference, rnai)现象是一种进化上保守的抵御或外来---qin犯的防御机制。将含有靶基因mrna同源互补序列的rna(double strand rna, dsrna)导入细胞后,能够特异地识别该mrna,引起mrna的降解,pcr,从而导致相应的功能缺失。rnai提供了一种经济、快捷、gao效的抑制特异基因表达的技术手段,该技术已被广泛用于研究基因功能和chuan染性---及恶xingzhong瘤基因zhi疗领域。目前常用的rna干扰手段为mirna、 shrna和sirna等。
mirna是一类可以通过rnai机制调节基因表达的内源性小rna,人工mirna与shrna的设计原理基本相同,由于mirna具有内源性,因此其更易产生有效的基因沉默。
技术流程:
dsrna或pre-mirna被导入细胞后,能够被一种特异的---内切酶(dicer)识别并切割成为小片段,pcr,这些片段在rna解旋酶的作用下解链。继之反义链在与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成rna---的沉默复合物(rna-induced silencing complex,risc),risc与mrna同源区进行特---结合,若mirna与mrna的结合位点配对,则切割mrna;若mirna与mrna的结合位点不配对,则抑制mrna的翻译。
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