dna测序检测
1. pcr测序反应
(1)取0.2ml的pcr管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂:
所加试剂测定模板管标准对照管
bigdye mix
1μl
1μl
待测的质粒dna
1μ 1
pgem-3zf (+)双链dna
-1μ1
待测dna的正向引物
1μ 1
m13(-21)引物- 1μ 1
灭菌去离子水
2μ 1
2μ 1
总反应体积5μ 1，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧pcr管，用手指弹管混匀，稍离心。
(2)将pcr管置于9600或2400型pcr仪.上进行扩增。98c变性2min后进行pcr循环，
pcr循环参数为96c 10s，荧光定量pcr， 50c 5s，实时荧光定量pcr， 60°c4min， 25 个循环，扩增结束后设置4c保温。
2.---法纯化pcr产物
(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml ep管中。
(2)加入25μ 1/---混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀dna。12 000r/min于
4c离心30 min，小心弃上清。
(3)加70%(v/v)的---50μ 1 洗涤沉淀2次。12 000r/min 于4c离心5min，小心弃上清和
管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。
3.电泳前测序pcr产物的处理。
(1)加入12μ 1的tsr于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解dna沉淀，稍离心。
(2)将溶液转移至盖体分离的0.2ml pcr管中，稍离心。
(3)在pcr仪上进行热变性(95c 2min)，冰中骤冷，---怎么做，待_上机。
4..上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立
运行的测序顺序文件。
5.仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过
序列比较以星号标出差异碱基处，湖州pcr，提高工作效率。
6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。
rna提取预备工作
rna酶（rnase）是导致rna降解主要的物质。此酶非常稳定，在一些的条件下只可暂时失活，但---因素去除后又迅速恢---性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制ji不能使所有的rnase完全失活。
1.它广泛存在于人的皮肤上，因此制备rna时必须戴手套
2.rnase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以depc配制的70%---擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求。
3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理
（1）塑料制品：尽量使用---无菌塑料制品。已标明rnase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常不必再处理。
甲l基化特---的pcr
herman 等（ 1996 ）在使用重---酸盐处理的基础上新建的一种方法。该方法敏感性高，主要用于作定性研究。用------盐处理基因组dna，所有未发生jia基化的胞嘧定被转化为尿嘧ding，而jia基化的胞嘧定不变；随后设计针对jia基化和非jia基化序列的引物进行pcr。通过电泳检测msp扩增产物，如果用针对处理后jia基化dna链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在jia基化；反之，说明被检测的位点不存在jia基化。
特点：适用范围广，能够检测特异位点是否发生jia基化。
------盐测序法（bisulfite sequencing pcr，bsp）
------盐修饰后测序法（ bsp ） frommer 等（ 1992 ）提出的研究 dna jia基化方法，此方法---性及jing确度高，能明确目的片段中每一个 cpg 位点的jia基化状态。用------盐处理基因组dna，所有未发生jia基化的胞嘧ding被转化为尿嘧ding，而jia基化的胞嘧ding不变。随后设计bsp引物进行pcr，在扩增过程中尿嘧定全部转化为胸腺嘧定，zui后对pcr产物进行测序就可以判断cpg位点是否发生jia基化，称为bsp-直接测序法。将pcr产物克long至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为bsp-ke隆测序法。
特点：jing确度高，能够准确检测出jia基化的程度百分比。
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