分子实验介绍——荧光定量pcr检测
荧光定量pcr是检测生物样品中rna含量的普遍的方法，通过荧光染料或荧光标记的特---的探针，对pcr产物进行标记---，荧光定量pcr，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。目前主要使用sybr green和taqman法对rna含量进行检测。sybr green在低样本量时成本较低，目前选用的较多。
sybr green i是一种只与dna双链结合的荧光染料。当它与dna双链结合时，发出荧光；从dna双链上释放出来时，浙江pcr，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链dna分子的数量。sybr green荧光染料法定量pcr的基本过程是：1、开始反应，当sybr green染料与dna双链结合时发出荧光。2、dna变性时，sybr green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成pcr产物。4、聚合完成后，sybr green染料与双链产物结合，定量pcr系统检测到荧光的净增量加大。
实验流程：细胞或组织rna提取-rna浓度检测-rna逆转录-定量pcr检测。
结果示例：
图 a 基因扩增曲线图；b 基因扩增溶解曲线图；c mrna相对表达量变化
从图中可以扩增曲线可以看出目的rna扩增效果，溶解曲线可以看出引物识别特---情况，通过使用δδct方法计算可以得到每个组中目的mrna表达变化。
二、操作步骤：
1. 所有在纯化系统里使用的溶液当日都需要经过 0.22μm 的滤膜抽滤、脱气处理；保存 4℃ 冰箱里的缓冲液若要在室温使用需恢复至室温后抽滤脱气；
2. 样品上柱纯化前，需先滤膜过滤，少量样品可用离心（13000rpm，10min）；
3. 依次用水、缓冲液洗泵；设置流速和柱前警报压（压力值参阅层析柱及填料说明书，取较小的一个大耐受压力）。防止柱中进入气泡，影响分离效果；
4. 当柱子限压在 0.3mpa，或者在限压状态---速很低时，ph valve 中的 restirtor 可以切换成 off line，即显示 by-pass 状态；
5. 当需要通过仪器上样环上样时，将 w1 阀口处换成带透明短软管的阀门，从此处阀门位通过倒吸样品上样；
6. 进样阀「inject」为上样状态。上样结束可将进样阀切换回「load」状态。并用纯水认真清洗上样环至少 3 次；将 w1 阀口处换回原来接头阀门。
7. 纯化结束后，用纯水清洗泵和平衡柱子；再用 20% 的---清洗泵以及系统。长期不用，层析柱应保存在 20% 的---中，泵放置在 20% ---中；
8. 实验结束后及时倾倒废液瓶里的废液；
注意事项
1. 为了避免蛋白---性，---多少钱，不要对样品剧烈搅动和反复冻融。
2. 缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环。。
3. 为了避免蛋白质的氧化，将 0.1～1 mmol/ldtt（二硫苏糖醇）(或 β-巯）加入到缓冲溶液中。
4. 为了避免重金属对目标蛋白的破坏，---怎么做，将 1～10 mmol/ledta 金属螯合剂加入。
5. 为了避免微生物生长，使用灭菌溶液。在纯化任何一种蛋白质的时候，均必须时刻对它的稳定性注意维护，使它的活性得到保护，需要牢记如下一些通用的注意事项。
6. 尽可能置于冰上或者在冷库内进行操作。
7. 蛋白浓度不要太稀。
8. 除非是进行---层。否则 ph 需要合适，防止所使用的缓冲溶液 ph 与 pi 相同，使蛋白质的沉淀得以避免。
9. 使用蛋白酶，避免蛋白酶对目标蛋白的降解；在纯化细胞中的蛋白质时，将 dna 酶加入来使得 dna 降解，避免 dna 对蛋白的污染。
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