分子实验介绍——荧光检测
细胞荧光染色是以荧光物质标记而进行抗原定位的技术。在细胞中，pcr，通过特定的标记，可以检测目的蛋白表达量和表达定位。是细胞中的可直观观察细胞内蛋白定位和表达的实验方法。
实验流程：细胞固定-细胞膜破膜-蛋白封闭-目的蛋白结合-荧光二抗结合-dapi染色-荧光显微镜拍照或激光共---显微镜拍照。
结果示例：
细胞荧光染
通过观察细胞中蛋白的荧光强度和定位分析该蛋白的表达变化。
rna提取及注意事项
研究基因的表达和调控时，需要从组织或细胞中分离纯化rna。rna的高低经常影响rt-pcr、cdna库构建和northern blot等分子生物学实验的成败。
主要试剂
trizol是一种新型总rna抽提试剂，内含异---胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的---酶。
1.
trizol试剂含有，具有毒性和---性，注重操作。
2.
rnase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注重配带手套，样品尽可能盖严。
3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低后得率，因为一部分rna会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质（结缔组织和骨除外）。在清洗和裂解细胞时在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源rnase降解了rna。
4. 酵母和一些---由于细胞壁的---结构，可以加入trizol试剂同时加入无rnase的玻璃珠并剧烈振荡，实时荧光定量pcr，使细胞裂解充分。
2-8℃ 避光保存一年。
分子与质粒载体构建
实验原理
外源dna与载体分子的连接就是dna重组，这样重新组合的dna叫做重组体或重组子。重组的dna分子是在dna连接酶的作用下，有mg2+、atp存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源dna分子进行连接。dna连接酶有两种：t4噬菌体dna连接酶和大肠dna连接酶。两种dna连接酶都有将两个带有相同粘性末端的dna分子连在一起的功能，而且t4噬菌体dna连接酶还有—种大肠连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链dna分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高t4噬菌体dna连接酶浓度或增加dna浓度来提高平末端的连接效率。
t4噬菌体dna连接酶催化dna连接反应分为3步：，四川pcr，t4dna连接酶与辅助因子atp形成酶—amp复合物；然后，酶—amp复合物再结合到具有5’磷酸基和3’---切口的dna上，fish检测，使dna腺苷化；后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
dna重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过(牛碱性磷酸酶)cip处理克服。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性.但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即12-16℃，连接12-16h(过夜)，这样既可大限度地发挥连接酶的活性，又---到短暂配对结构的稳定。
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