rna提取预备工作
rna酶（rnase）是导致rna降解主要的物质。此酶非常稳定，在一些的条件下只可暂时失活，pcr引物设计，但---因素去除后又迅速恢---性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制ji不能使所有的rnase完全失活。
1.它广泛存在于人的皮肤上，因此制备rna时必须戴手套
2.rnase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以depc配制的70%---擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求。
3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理
（1）塑料制品：尽量使用---无菌塑料制品。已标明rnase-free的塑料制品，如没有开封使用过，pcr，通常不必再处理。
rna提取及注意事项
研究基因的表达和调控时，需要从组织或细胞中分离纯化rna。rna的高低经常影响rt-pcr、cdna库构建和northern blot等分子生物学实验的成败。
主要试剂
trizol是一种新型总rna抽提试剂，内含异---胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的---酶。
1.
trizol试剂含有，具有毒性和---性，注重操作。
2.
rnase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注重配带手套，样品尽可能盖严。
3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低后得率，因为一部分rna会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质（结缔组织和骨除外）。在清洗和裂解细胞时在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源rnase降解了rna。
4. 酵母和一些---由于细胞壁的---结构，可以加入trizol试剂同时加入无rnase的玻璃珠并剧烈振荡，使细胞裂解充分。
2-8℃ 避光保存一年。
分子实验介绍——荧光定量pcr检测
荧光定量pcr是检测生物样品中rna含量的普遍的方法，通过荧光染料或荧光标记的特---的探针，对pcr产物进行标记---，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。目前主要使用sybr green和taqman法对rna含量进行检测。sybr green在低样本量时成本较低，目前选用的较多。
sybr green i是一种只与dna双链结合的荧光染料。当它与dna双链结合时，发出荧光；从dna双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链dna分子的数量。sybr green荧光染料法定量pcr的基本过程是：1、开始反应，pcr实验室，当sybr green染料与dna双链结合时发出荧光。2、dna变性时，sybr green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成pcr产物。4、聚合完成后，sybr green染料与双链产物结合，定量pcr系统检测到荧光的净增量加大。
实验流程：细胞或组织rna提取-rna浓度检测-rna逆转录-定量pcr检测。
结果示例：
图 a 基因扩增曲线图；b 基因扩增溶解曲线图；c mrna相对表达量变化
从图中可以扩增曲线可以看出目的rna扩增效果，溶解曲线可以看出引物识别特---情况，通过使用δδct方法计算可以得到每个组中目的mrna表达变化。
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