16.长链引物为什么出错的几率非常高？
答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%，产生碱基插入、缺失、置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，荧光定量pcr，这种心情可以理解。但是---pcr扩增，不可能---扩增产物中没有突变，引物合成也不可能---100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保---温聚合酶pcr扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。
17.如果测序发现突变，该如何处理？
答：遇到这种情况，首先和---合成厂家取得联系，fish检测，生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，他们在电脑中一般会保留所有原始数据。在确认引物合成序列没有输错的情况下，建议重新挑取测序，可能会找到正确的。根据经验，40个碱基以下的引物，测1-2个就可以了；40个以上的---是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。也可以要求公司将引物免费重合一次，不过重合的引物和次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。
25.pcr扩增不出就引物有问题吗？
答：基本不是。当今发展出各色各样的pcr扩增技术，各色各样的高温聚合酶，就是来解决pcr扩增中遇到的扩不出、扩增效率低的问题。如巢式pcr就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。 有些重复片段的扩增， gc含量高的片段，非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。
引物扩增不出，主要是下列两种情况比较常见：
（1） rt-pcr。请注意，很多基因通过常规rt -pcr方法是很难扩增出来的。 rt- pcr成功的关键在于rt的反应的rna和目标基因在特定组织和细胞中含量。
（2）从基因组中扩增。一般情况下，基因在基因组中都是单拷贝，基因组作为模板需要严格控制用量。基因组dna过高，会影响反应体系中的mg和ph
dna测序检测
1. pcr测序反应
(1)取0.2ml的pcr管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂:
所加试剂测定模板管标准对照管
bigdye mix
1μl
1μl
待测的质粒dna
1μ 1
pgem-3zf (+)双链dna
-1μ1
待测dna的正向引物
1μ 1
m13(-21)引物- 1μ 1
灭菌去离子水
2μ 1
2μ 1
总反应体积5μ 1，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧pcr管，用手指弹管混匀，稍离心。
(2)将pcr管置于9600或2400型pcr仪.上进行扩增。98c变性2min后进行pcr循环，
pcr循环参数为96c 10s， 50c 5s， 60°c4min， 25 个循环，扩增结束后设置4c保温。
2.---法纯化pcr产物
(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml ep管中。
(2)加入25μ 1/---混合液，充分振荡，上海pcr，置冰上10min以沉淀dna。12 000r/min于
4c离心30 min，小心弃上清。
(3)加70%(v/v)的---50μ 1 洗涤沉淀2次。12 000r/min 于4c离心5min，小心弃上清和
管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。
3.电泳前测序pcr产物的处理。
(1)加入12μ 1的tsr于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解dna沉淀，稍离心。
(2)将溶液转移至盖体分离的0.2ml pcr管中，稍离心。
(3)在pcr仪上进行热变性(95c 2min)，冰中骤冷，实时荧光定量pcr，待_上机。
4..上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立
运行的测序顺序文件。
5.仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过
序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。
6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。
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