pcr检测-英瀚斯-西藏pcr

分子与质粒载体构建

实验原理

外源dna与载体分子的连接就是dna重组，这样重新组合的dna叫做重组体或重组子。重组的dna分子是在dna连接酶的作用下，有mg2+、atp存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源dna分子进行连接。dna连接酶有两种：t4噬菌体dna连接酶和大肠dna连接酶。两种dna连接酶都有将两个带有相同粘性末端的dna分子连在一起的功能，而且t4噬菌体dna连接酶还有—种大肠连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链dna分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高t4噬菌体dna连接酶浓度或增加dna浓度来提高平末端的连接效率。

t4噬菌体dna连接酶催化dna连接反应分为3步：，t4dna连接酶与辅助因子atp形成酶—amp复合物；然后，酶—amp复合物再结合到具有5’磷酸基和3’---切口的dna上，使dna腺苷化；后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。

dna重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，实时荧光定量pcr，可以通过(牛碱性磷酸酶)cip处理克服。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性.但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即12-16℃，连接12-16h(过夜)，这样既可大限度地发挥连接酶的活性，又---到短暂配对结构的稳定。

蛋白质质谱鉴定服务

蛋白质（protein）是有机大分子，是构成细胞的基本有机物和生命活动的主要承担者。蛋白质在催化生命体内各种反应进行、---、抵御外来物质入l侵及控制遗传信息等方面都起着重要的作用。蛋白质的一级结构是---酸序列，西藏pcr，通过鉴定---酸序列来匹配它的蛋白质，这是定性研究，是蛋白质组学的基础，pcr检测，也是蛋白质组学的重要技术之一。

质谱一般由离子源、分析器（mass ---yzer）和离子检测器（detector）三部分组成。传统的质谱仅用于小分子挥发物质的分析，但随着新的离子化技术的出现，如基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof)和电喷雾电离质谱(esi-ms)等，质谱技术的出现为蛋白质分析提供了一种新的途径。现在蛋白质组学基本研究手段是：以生物质谱技术为，对蛋白质进行---、高通量分离、鉴定和分析。

蛋白质质谱鉴定的基本原理是用蛋白酶将蛋白质---成肽段混合物，经maildi或esi等软电离手段将其离子化，然后通过分析器将具有特定质核比的肽段离子分离开来。通过实际谱图和理论上蛋白质经过蛋白酶---后产生的一级质谱峰图和二级质谱峰图进行的比对，进行蛋白鉴定。