----pcr-南京英瀚斯

细胞荧光染

通过观察细胞中蛋白的荧光强度和定位分析该蛋白的表达变化。

1. 引物是如何合成的？

目前引物合成基本采用固相亚---胺三酯法。dna合成仪有很多种， 主要都是由abi/pe 公司生产，而bioneer自行研制的384并行高通量dna合成仪，可实现99%的高合成率。无论采用什么机器合成，pcr，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

亚---胺三酯法合成dna，具有、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚---胺三酯法是将dna固定在固相载体上完成dna链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′***5′磷酸二酯键连接。

步是将预先连接在固相载体cpg上的活性基团被保护的核苷酸与---反应，脱去其5′----的保护基团dmt，获得游离的5′----。

第二步，合成dna的原料，亚---胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′----仍然被dmt保护，与溶液中游离的5′----发生缩合反应。

第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有数5′----没有参加反应(少于2%)，用酐和1-咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步，pcr引物设计，在氧化剂碘的作用下，亚---形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以---脱去它的5′----上的保护基团dmt，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察tca处理阶段的颜色判定合---率。

通过---高温处理，pcr，连接在cpg上的引物被切下来，通过opc，和page等手段纯化引物，成品引物用c18浓缩、脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定od260定量，根据定单要求分装。