rna提取及注意事项
研究基因的表达和调控时,需要从组织或细胞中分离纯化rna。rna的高低经常影响rt-pcr、cdna库构建和northern blot等分子生物学实验的成败。
主要试剂
trizol是一种新型总rna抽提试剂,内含异---胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的---酶。
1.
trizol试剂含有,具有毒性和---性,注重操作。
2.
rnase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉,pcr引物设计,注重配带手套,样品尽可能盖严。
3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低后得率,因为一部分rna会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质(结缔组织和骨除外)。在清洗和裂解细胞时在低温下操作,防止在操作过程中释放的内源rnase降解了rna。
4. 酵母和一些---由于细胞壁的---结构,可以加入trizol试剂同时加入无rnase的玻璃珠并剧烈振荡,使细胞裂解充分。
2-8℃ 避光保存一年。
mirna测序
microrna(mirna)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子rna,是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链rna前体经过dicer酶加工后生成,不同于sirna(双链)但是和sirna密切相关。microrna通过和靶基因mrna碱基配对引导沉默复合体(risc)降解mrna或抑制mrna的翻译,从而在转录后水平调控蛋白表达(新发现mirna也能在转录水平调控基因表达)。mirna在物种进化中相当保守,在动物、植物和---等中发现的mirna表达均有严格的组织特---和时序性。mirna在细胞生长和发育过程中起多种作用,包括调控发育、分化、凋亡和增殖等。
目前研究mirna的方法主要是realtime-pcr、生物芯片技术以及第二代测序技术。基于第二代测序技术的mirna测序,可以一次获得数百万条mirna序列,能够快速鉴定出不同组织、不同发育阶段、不同---状态下已知和未知的mirna及其表达差异,为研究mirna对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。
单核苷酸多态性( snp )实验
snp (single nucleotide polymorphisn即单核苷酸多态性 ,是由于单个核苷酸改变而导
实验方法原理:
snp (single nucleotide polymorphisn即单核苷酸多态性,是由于单个核苷酸改变而导
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