pcr实验室-pcr-南京英瀚斯

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    2023-8-11

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rna提取及注意事项



研究基因的表达和调控时,需要从组织或细胞中分离纯化rna。rna的高低经常影响rt-pcr、cdna库构建和northern blot等分子生物学实验的成败。

主要试剂

trizol是一种新型总rna抽提试剂,内含异---胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的---酶。

1.

trizol试剂含有,具有毒性和---性,注重操作。

2.

rnase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉,pcr引物设计,注重配带手套,样品尽可能盖严。

3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低后得率,因为一部分rna会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质(结缔组织和骨除外)。在清洗和裂解细胞时在低温下操作,防止在操作过程中释放的内源rnase降解了rna。

4. 酵母和一些---由于细胞壁的---结构,可以加入trizol试剂同时加入无rnase的玻璃珠并剧烈振荡,使细胞裂解充分。

2-8℃ 避光保存一年。






mirna测序

microrna(mirna)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子rna,是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链rna前体经过dicer酶加工后生成,不同于sirna(双链)但是和sirna密切相关。microrna通过和靶基因mrna碱基配对引导沉默复合体(risc)降解mrna或抑制mrna的翻译,从而在转录后水平调控蛋白表达(新发现mirna也能在转录水平调控基因表达)。mirna在物种进化中相当保守,在动物、植物和---等中发现的mirna表达均有严格的组织特---和时序性。mirna在细胞生长和发育过程中起多种作用,包括调控发育、分化、凋亡和增殖等。

目前研究mirna的方法主要是realtime-pcr、生物芯片技术以及第二代测序技术。基于第二代测序技术的mirna测序,可以一次获得数百万条mirna序列,能够快速鉴定出不同组织、不同发育阶段、不同---状态下已知和未知的mirna及其表达差异,为研究mirna对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。





单核苷酸多态性( snp )实验

snp (single nucleotide polymorphisn即单核苷酸多态性 ,是由于单个核苷酸改变而导致的---序列多态性(polymorphism)。据估计,pcr实验室,在人类基因组中,大约每千个碱基中有一个snp ,pcr,无论是比较于度多态性(rflp)分析还是微标记(str) ,pcr实验室,都要广泛得多。

实验方法原理:

snp (single nucleotide polymorphisn即单核苷酸多态性,是由于单个核苷酸改变而导致的---序列多态性(polymorphism)。据估计,在人类基因组中,大约每千个碱基中有一个snp ,无论是比较于---性段长度多态性(rflp)分析还是微标记(str) ,都要广泛得多。snp是我们考察遗传变异的单位,据估计,人类的所有群体中大约存在一千万个snp位点。-般认为,相邻的snps倾向于一起遗传给后代。 于是,我们把位于染色体上某一区域的一组相关联的snp等位位点称作单体型( haplotype b大多数染色体区域只有少数几个常见的单体型(每个具有至少5%的频率),它们代表了一个群体中人与人之间的大部分多态性。-个染色体区域可以有很多snp位点,但是我们一-旦掌握了这个区域的单体型,就可以只使用少数几个标签snps(tagsnp)来进行基因分型,获取大部分的遗传多态模式。






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