关于引物的常见问题汇总:
1. 引物是如何合成的？
目前引物合成基本采用固相亚---胺三酯法。dna合成仪有很多种，pcr， 主要都是由abi/pe 公司生产，而bioneer自行研制的384并行高通量dna合成仪，可实现99%的高合成率。无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
亚---胺三酯法合成dna，具有、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚---胺三酯法是将dna固定在固相载体上完成dna链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′***5′磷酸二酯键连接。
步是将预先连接在固相载体cpg上的活性基团被保护的核苷酸与---反应，脱去其5′----的保护基团dmt，pcr，获得游离的5′----。
第二步，合成dna的原料，亚---胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′----仍然被dmt保护，与溶液中游离的5′----发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有数5′----没有参加反应(少于2%)，用酐和1-咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，pcr引物设计，亚---形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以---脱去它的5′----上的保护基团dmt，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察tca处理阶段的颜色判定合---率。
通过---高温处理，连接在cpg上的引物被切下来，通过opc，和page等手段纯化引物，成品引物用c18浓缩、脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定od260定量，根据定单要求分装。
蛋白提取
大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，荧光定量pcr， 少数与脂类结合的蛋白质则溶于---、---等有ji溶剂中，因些，可 采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
(一)水溶液提取法
稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度---于溶 解，缩短提取时间。但另一方面. ，温度升高会使蛋白---性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温( 5度以下)操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白 水解酶抑zhi剂(如二yi------，碘yi酸等)。
分子实验介绍——印迹（western blot）检测
通过sds-page凝胶将细胞或生物样品内的蛋白按照蛋白分子量从大到小规律分离开。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如纤维素薄膜或pvdf膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的起反应，再与酶或同位素标记的第二起反应（目前主要用hrp标记的第二），经过底物显色或自显影以检测电泳分离的特---目的基因表达的蛋白成分（目前主要使用鲁米诺和二---的hrp反应发出荧光，通过仪器或者胶片显色）。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验流程：细胞收集-细胞裂解，蛋白提取-蛋白变性-sds-page电泳-蛋白质转膜印记-蛋白封闭-目的孵育-二抗孵育-显色拍照
结果示例：
图 a不同大小的质粒转染细胞后，western blot检测图片；b a蛋白不同培养时间后western blot检测图片；c 使用image pro plus软件对a蛋白灰度检测，a蛋白表达变化统计图
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