细胞实验介绍——流式细胞术检测细胞周期和凋亡
流式细胞术检测细胞周期:
细胞周期:指细胞从---次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程,通常由g0/g1期、s期、g2期和m期组成。g0/g1期:有丝分裂发生,细胞分裂成两个细胞,进入下一个细胞周期,或者进入静止期(g0期),而g0期从dna含量上无法与g1期区分,河北细胞实验,细胞开始rna和蛋白质的合成,但dna含量仍保持二倍体。s期:dna开始合成,细胞实验外包费用,细胞核内dna的含量介于g1期和g2期之间。g2期和m期:当dna成为4倍体时,细胞进入g2期。g2期细胞继续合成rna及蛋白质,直到进入m期。
pi法是---的周期检测方法。pi为插入性---荧光染料,能选择性的嵌入---dna和rna双链螺旋的碱基之间与之结合,其结合的量与dna的含量成正比例关系,用流式细胞仪进行分析,细胞实验外包,就可以得到细胞周期各个阶段的dna分布状态,细胞实验外包选,从而计算出各个期的百分含量。
一般流程:细胞收集-70%酒精固定过夜-pi染色-流式细胞仪检测。
细胞凋亡:细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(ps)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在之前,检测ps的表达,能反映早期凋亡。annexinv是ca2+依赖的磷脂结合蛋白,对ps有---的亲和性,并且可以与暴露于细胞外的ps相结合。利用这一原理,可以将annexinv标记荧光来识别早期的细胞凋亡。通常利用annexinv-fitc和碘化丙啶(pi)来区分凋亡和坏---。pi的膜通透性很差,因而只能标记坏死的细胞。
一般流程:细胞收集-pi-annexinv标记-流式细胞仪检测。
结果示例:
图 a 细胞周期检测图;b 细胞凋亡检测图
q:如何避免中沉淀物的出现?
a:首先要注意正确的解冻步骤,而且溶解过程中一定要每隔一段时间均匀而缓慢的摇动。我们已经发现在下列情况下沉淀物可能增加,使用中应该尽量避免:
(1)热灭活;
(2)在 37℃ 下培养;
(3)反复冻融;
(4)γ 射线照射;
(5)长期储存在 2-8℃;
(6)在室温下放置时间过长
q:如何去除中的沉淀?
a:如想去除这些絮状沉淀物,可以将分装到无菌离心管中,以 400g 离心,上清液即可直接加入到培养基 内一起过滤。
注意:不要以过滤的方式去除这些絮状沉淀物,因为这可能阻塞滤膜。
小鼠成骨细胞和破骨细胞共培养模型的建立
细胞之间的相互调控作用奠定基础.方法利用24 h内新生小鼠颅骨和4~8周龄成年小鼠四肢长分别分离、培养成骨细胞和破骨细胞,采用间接接触的培养模式将接种了骨sui单核细胞的玻片或骨片置入提前24 h接种了成骨细胞的培养皿中进行共培养.共培养-定时间后进行破 骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,trap染色鉴定和骨吸收功能检测,并进一 步采用rt- pcr对破骨细胞标志酶基因基质金属蛋白酶.9(mmp-9)、trap 和组织蛋白酶k (cathepsin k )的表达进行检测结果共培养5天后---trap(+)多核细胞形成13天trap(+ )多核细胞数目达到高峰;骨吸收陷窝在共培养7天后开始出现,随着培养时间的延长,陷窝面积呈增加趋势;破骨细胞标志基因trap在共培养3天时开始表达,而mmp-9和cathepsin k则在共培养5天后表达结论共培养体系中成骨细胞对破骨细胞调控作用------的破骨细胞具有噬骨能力,该共培养模型可用于成骨细胞和破骨细胞之间的相互调控作用研究.
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