细胞实验外包-扬州细胞-南京英瀚斯生物科技

细胞实验介绍——慢---建立稳转细胞系

慢---包装：公司使用3质粒慢---包装系统，慢---系统使用plko.1-egfp、pspax2、pmd2.g，过表达慢---系统使用plvx-acgfp、pspax2、pmd2.g三质粒系统，将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法转染至hek293t细胞中，流式细胞技术，培养48h后，收集上清。使用genecopo公司慢---颗粒纯化试剂盒将慢---纯化。纯化后留取部分检测---滴度，其余---冻存于-80℃冰箱中。

滴度检测：将---颗粒使用梯度稀释，分别293t细胞，72h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算---滴度。

细胞：在---前---对细胞进行计数，接种约10000个细胞于12孔板中，培养过夜后使用无培养基稀释---，加入12孔板中对细胞进行，---数量根据细胞的moi加入（若无moi，需做---梯度：1，---，5，细胞实验外包，10，50，100 5个梯度对细胞），6h后去除含---溶液，加入完全培养基细胞培养，培养48h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。同时加入puromycin对细胞筛选，筛选约2周时间。细胞筛选好后，使用定量pcr和western blot检测目的基因的稳定表达情况。

实验流程：慢---质粒构建-hek293t细胞培养-质粒转染293t细胞----收集----纯化----滴度检测-细胞-稳转细胞筛选-稳转细胞鉴定

结果示例：

                                               图 a ---滴度检测；b 目的细胞---效果图

小鼠精原gan细胞分离富集和培养

成年小鼠gao丸中约有108个细胞，其中约有 2×104个是精原gan细胞，仅占gao丸生精上皮细胞总数的 0.02～0.03%，精原gan细胞数量太少不利于体外培养.分离和富集精原gan细胞成为精原gan细胞体外培养能否成功的前提条件.寻找分离和富集小鼠精原gan细胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠为实验对象，先用0.25%胰酶1mm edta---gao丸10min，用胎牛xue清终止---，用一次40-um孔径的滤器过虑制成单 细胞悬液，30%percoll不连续密度梯度法离心富集精原gan细胞，再根椐未分化精原gan细胞表面thy1.2(cd90.2)阳性cd117(c- kit)阴性特点用流式细胞仪将精原gan细胞分选出来，并在体外进行培养尝试. 结果:30%percoll密度梯度离心前cd117(c-kit)阳性细胞占13.80±3.34%，cd90.2阳性细胞占28.98±4.51%， 二者都阳性细胞占8.98±2.98%，cd117阴性cd90.2阳性细胞占18.36±2.67%;离心后 cd117(c-kit)阳性细胞占12.37±3.34%，cd90.2阳性细胞占56.98±4.51%，二者都阳性细胞占 8.20±3.98%，cd117阴性cd90.2阳性细胞占32.36±3.67%;cd117(c-kit)阳性细胞和二者都阳性细胞所占百分比前后 比较差异无---性(p>;0.1)，cd90.2阳性细胞和cd117阴性和cd90.2阳性细胞所占百分比前后比较差异有---性 (p<0.05);采用cd117和cd90.2作为标志分子，percoll离心后细胞悬液经facs分选后获得细胞纯度