细胞实验外包选-英瀚斯-广元细胞实验

小鼠精原gan细胞分离富集和培养

成年小鼠gao丸中约有108个细胞，其中约有 2×104个是精原gan细胞，仅占gao丸生精上皮细胞总数的 0.02～0.03%，精原gan细胞数量太少不利于体外培养.分离和富集精原gan细胞成为精原gan细胞体外培养能否成功的前提条件.寻找分离和富集小鼠精原gan细胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠为实验对象，先用0.25%胰酶1mm edta---gao丸10min，用胎牛xue清终止---，用一次40-um孔径的滤器过虑制成单 细胞悬液，30%percoll不连续密度梯度法离心富集精原gan细胞，再根椐未分化精原gan细胞表面thy1.2(cd90.2)阳性cd117(c- kit)阴性特点用流式细胞仪将精原gan细胞分选出来，细胞实验外包，并在体外进行培养尝试. 结果:30%percoll密度梯度离心前cd117(c-kit)阳性细胞占13.80±3.34%，广元细胞实验，cd90.2阳性细胞占28.98±4.51%， 二者都阳性细胞占8.98±2.98%，cd117阴性cd90.2阳性细胞占18.36±2.67%;离心后 cd117(c-kit)阳性细胞占12.37±3.34%，cd90.2阳性细胞占56.98±4.51%，二者都阳性细胞占 8.20±3.98%，cd117阴性cd90.2阳性细胞占32.36±3.67%;cd117(c-kit)阳性细胞和二者都阳性细胞所占百分比前后 比较差异无---性(p>;0.1)，cd90.2阳性细胞和cd117阴性和cd90.2阳性细胞所占百分比前后比较差异有---性 (p<0.05);采用cd117和cd90.2作为标志分子，percoll离心后细胞悬液经facs分选后获得细胞纯度

软gu细胞培养

(1)---脱颈处死，备皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮肤。

(2)无菌操作下取下双侧股骨头及膝关节(保留周围肌肉，软gu不能暴露)，75%酒精浸泡5分钟，转移至pbs缓冲液中，细胞实验外包公司，带入超净工作台，剔除关节周围附着的软组织，打开髋、膝关节，用尖刀削取关节软gu组织，置入装有pbs缓冲液的无菌培养皿，防止软gu组织被风干。

(3)pbs缓冲液充分漂洗软gu小块3次，然后用小剪刀将软gu块切碎至约imm3大小。

(4)再次用pbs缓冲液冲洗3次，滤干，将细小的软gu块置入放有0.2%的ii型胶原酶3ml的广口瓶里，摇匀后置于37°c恒温震荡箱中---，40分钟后将上层---液转移至15ml规格离心管中，800r/min离心5min，收集细胞(沉淀物)，加入含10%的胎牛xue清dmem培养液4ml并吹打混匀，制成软gu细胞混悬液。

(5)把---所得的软gu细胞混悬液收集于离心管中，经滤网过滤后用细胞计数板计数，并把细胞混悬液密度调整为2x105/ml接种于25cm2规格的培养瓶中。将培养瓶放置于co2培养箱内。培养条件为37°c、5%co2。

(6)未---完的软gu小块继续用ii型胶原酶如_上法---，直至软gu块基本消失。

(7)每日在倒置显微镜下观察软gu细胞生长情况并拍照保存。