实时定量pcr-pcr-南京英瀚斯

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    2023-9-28

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常规碱基分子量:



11.如何溶解引物?

答:干燥后的引物质地非常疏松,开盖前好离心一下,或管垂直向上在桌面上敲敲,将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mm tris ph7.5缓冲液,室温放置几分钟,振荡助溶,离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水,因为有些蒸馏水的ph值比较低(ph4-5),引物在这种条件下不稳定。

12.如何保存引物?

答:引物合成后,经过一系列处理和纯化步骤,旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前,室温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高,---,合成的od数较大,pcr,建议分装,避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。




13.合成的引物5端是否有磷酸化

答:合成的引物5为---,pcr引物设计,没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5′端磷酸化,或者要求引物合成公司合成时直接在5′或3′端进行磷酸化,需要另外收费。

14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题?

连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上,引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上,需要检查载体的酶切效果,需要---引物退火的条件。sirna分子具有特殊的对称结构,退火的难度较大,实时定量pcr,退火时需要提高退火温度。





外显子测序

外显子组测序(exome-seq)是对定向富集的基因组dna进行高通量测序,它能够以相对低的费用对人类外显子组进行拷问。2009年,外显子组捕获工具的出现,让外显子组测序这种技术迅速红起来。到目前为止,已有超过1万个外显子组被测序。

如今有多家公司推出了外显子组捕获试剂,包括罗氏nimblegen、安捷伦、illumina,还有现在的华大基因。这些方法究竟孰优孰劣,斯坦福大学医学院遗传学系的研究人员对市场上三个主流的外显子组测序平台进行了比较。该研究结果发表在上。研究人员利用安捷伦、illumina和nimblegen的外显子组测序平台对同一个人类---样品进行分析。他们的结 果表明,nimblegen平台作为一个使用高密度重叠探针的平台,尽管覆盖了较少的基因组区域,但在灵敏检测小的变异时所需的测序量也少。在同样获得80m测序数据的情况下,nimblegen有97%的目标序列达到10x以上的测序---,而其他产品只有90%。而安捷伦和illumina的探针能够在低密度下捕获更多数量的变异。此外,illumina还捕获了未翻译的区域,这是nimblegen和安捷伦平台无法靶定的。研究人员还比较了同一样品的外显子组测序和全基因组测序(wgs),显示外显子组测序能够检测到wgs错过的小变异。

除了文中提到了三个主流平台,外显子组捕获方面的新产品也在不断推出,研究人员的选择也将更广泛。罗氏nimblegen即将推出新一代的外显子液相捕获产品。这一新产品将可捕获64m的基因组序列,包括外显子以及mirna,它含与其他nimblegen液相捕获产品相同的2.1m高密度探针,以高xiao、均一、特异、的定向捕获。






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