南京英瀚斯-流式细胞实验-广西细胞

细胞实验介绍——慢---建立稳转细胞系

慢---包装：公司使用3质粒慢---包装系统，流式细胞实验，慢---系统使用plko.1-egfp、pspax2、pmd2.g，过表达慢---系统使用plvx-acgfp、pspax2、pmd2.g三质粒系统，将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法转染至hek293t细胞中，培养48h后，细胞生物学实验，收集上清。使用genecopo公司慢---颗粒纯化试剂盒将慢---纯化。纯化后留取部分检测---滴度，其余---冻存于-80℃冰箱中。

滴度检测：将---颗粒使用梯度稀释，分别293t细胞，细胞实验外包，72h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算---滴度。

细胞：在---前---对细胞进行计数，接种约10000个细胞于12孔板中，培养过夜后使用无培养基稀释---，加入12孔板中对细胞进行，---数量根据细胞的moi加入（若无moi，需做---梯度：1，5，10，50，100 5个梯度对细胞），6h后去除含---溶液，广西细胞，加入完全培养基细胞培养，培养48h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。同时加入puromycin对细胞筛选，筛选约2周时间。细胞筛选好后，使用定量pcr和western blot检测目的基因的稳定表达情况。

实验流程：慢---质粒构建-hek293t细胞培养-质粒转染293t细胞----收集----纯化----滴度检测-细胞-稳转细胞筛选-稳转细胞鉴定

结果示例：

                                               图 a ---滴度检测；b 目的细胞---效果图

脂质体瞬时转染

1、细胞h9c2 (hela) 6孔板hela1x10°/孔。

2、转染前换上没有抗sheng素的dmem+胎清(10%)。

3、将质粒dna (约2-4ul) 2ul 加入dorf管中+dmem至50u1。

4、脂质体5ul补培养基至50ul混匀静止5分钟(质粒与脂质体比例为1:2或1.5:2.5)。

5、将含有脂质体的培养基与含质粒的混合总体积100ul室温放置30分钟。

6、吸取混合物均匀加入每一个孔中。

7、将6孔板放入培养箱中继续培养6小时后吸出培养基换上新配置的培养基dmem6ml+胎清600u1+三抗300u1。

8、培养24小时。