英瀚斯-荧光定量pcr-南充pcr

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    2023-10-7

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染色质免l疫共沉淀技术(chip)

基于体内分析而发展的染色质免l疫沉淀分析chr omat in immunoprecipitat ionassay kit, chip)技术可以真实、完整地反映结合在dna序列上的调控蛋白。由于chip采用甲醛固定活l细胞或者组织的方法,因此能比较真实的反映细胞内tf与promoter的结合情况,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来,这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性,是深入分析癌l症、心血l管病以及中央神经系统紊乱等---主要通路的一-种非常有效的工具。

染色质免l疫沉淀分析(chip) 的基本原理是在活l细胞状态下,当用甲醛处理时,相互靠近的蛋白与蛋白、蛋白与---(dna或rna)之间会产生共价键。细胞内,当f与promoter相互结合时,它们必然靠的比较近或者契合在一起,这个时候用甲醛处理,能使它们之间产生共价键。固定的蛋白质dna复合物通过超声或酶处理将其随机切断为-定长度范围内的染色质小片段然后通过抗原抗l体的特---识别反应沉淀此复合体,特---地富集目的蛋白结合的dnal片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与dna相互作用的信息。通过qpcr或二代测序,筛选与目的蛋白互作的未知dna信息。





13.合成的引物5端是否有磷酸化

答:合成的引物5为---,实时荧光定量pcr,没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5′端磷酸化,南充pcr,或者要求引物合成公司合成时直接在5′或3′端进行磷酸化,需要另外收费。

14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题?

连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上,引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上,需要检查载体的酶切效果,荧光定量pcr,需要---引物退火的条件。sirna分子具有特殊的对称结构,退火的难度较大,退火时需要提高退火温度。





20.primer设计的基本原则是什么?

答:引物设计的下列原则供您参考。

◆引物长度一般在18-35mer。

◆g-c含量控制在40-60%左右。

◆避免近3端有酶切位点或发夹结构。

◆如果可能避免在3端5个碱基有2个以上的g或c。

◆如果可能避免在3端1个碱基为a。

◆避免连续相同碱基的出现,---是要避免gggg或更多g出现。

◆退火温度tm控制在 58-60c 左右。

◆如果是设计点突变引物,突变点应尽可能在引物的中间。

21.为什么引物的od260/od280小于1.5 ?

答:引物应该全是dna,pcr检测,但是od260/od280的比值为什么那么低,怎么会有蛋白质污染?引物化学合成,哪里有机会污染到蛋白质?需要---的是od260/od280的比值不能用来衡量引物的纯度。od260/od280的比值过低一般是由于引物中c/t 的含量比较高所致。下表是一个20mer 同聚体引物的od260/od280的比值,清楚表明od260/od280的比值与引物的碱基组成密切相关。





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