关于引物的常见问题汇总:
1. 引物是如何合成的？
目前引物合成基本采用固相亚---胺三酯法。dna合成仪有很多种， 主要都是由abi/pe 公司生产，而bioneer自行研制的384并行高通量dna合成仪，可实现99%的高合成率。无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
亚---胺三酯法合成dna，具有、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚---胺三酯法是将dna固定在固相载体上完成dna链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′***5′磷酸二酯键连接。
步是将预先连接在固相载体cpg上的活性基团被保护的核苷酸与---反应，fish检测，脱去其5′----的保护基团dmt，获得游离的5′----。
第二步，合成dna的原料，亚---胺保护核苷酸单体，江苏pcr，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′----仍然被dmt保护，与溶液中游离的5′----发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有数5′----没有参加反应(少于2%)，用酐和1-咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚---形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以---脱去它的5′----上的保护基团dmt，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察tca处理阶段的颜色判定合---率。
通过---高温处理，pcr实验室，连接在cpg上的引物被切下来，通过opc，和page等手段纯化引物，成品引物用c18浓缩、脱盐，荧光定量pcr，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定od260定量，根据定单要求分装。
20.primer设计的基本原则是什么？
答：引物设计的下列原则供您参考。
◆引物长度一般在18-35mer。
◆g-c含量控制在40-60%左右。
◆避免近3端有酶切位点或发夹结构。
◆如果可能避免在3端5个碱基有2个以上的g或c。
◆如果可能避免在3端1个碱基为a。
◆避免连续相同碱基的出现，---是要避免gggg或更多g出现。
◆退火温度tm控制在 58-60c 左右。
◆如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。
21.为什么引物的od260/od280小于1.5 ？
答：引物应该全是dna，但是od260/od280的比值为什么那么低，怎么会有蛋白质污染？引物化学合成，哪里有机会污染到蛋白质？需要---的是od260/od280的比值不能用来衡量引物的纯度。od260/od280的比值过低一般是由于引物中c/t 的含量比较高所致。下表是一个20mer 同聚体引物的od260/od280的比值，清楚表明od260/od280的比值与引物的碱基组成密切相关。
单核苷酸多态性( snp )实验
snp (single nucleotide polymorphisn即单核苷酸多态性 ，是由于单个核苷酸改变而导
实验方法原理:
snp (single nucleotide polymorphisn即单核苷酸多态性，是由于单个核苷酸改变而导
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