18.引物是经过page纯化的,为什么还有碱基缺失或插入?
答:理论---析型page变性电泳,可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备page电泳,新疆pcr,上样量都是非常大,电泳时的条带非常宽,带与带之间有重叠,分辨率已下降,电泳后割带回收目的引物时,很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象,page纯化的引物,---是长引物要的量都比较高,导致割的条带有时可能比较宽。建议:您如果减少od数,引物遇到的问题可能就会少一些。
19. taqman 探针设计的基本原则是什么?
答:下列原则供您参考。
◆taqman 探针位置尽可能靠近扩增引物(扩增产物50-150bp),但不能与引物重叠。
◆长度一般为18-40mer 。
◆g-c含量控制在40-80%左右。
◆避免连续相同碱基的出现,---是要避免gggg或更多g出现。
◆在引物的5端避免使用g。
◆选用比较多的碱基c。
◆退火温度tm控制在 68-70c 左右。
有用的荧光染料参数
lncrna测序
长链非编码rnas(long non-coding rnas,---怎么做,lncrnas)一般是指长度大于200 nt的rna,位于细胞核内或胞浆中,不参与蛋白质编码功能,以rna形式在多种层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控基因的表达水平,在生命活动中具有重要作用。
长链非编码rna测序(long non-coding rna sequencing,lncrna-seq)是一种使用特定方法降低样本中rrna 的丰度,对富集到的 rna进行---构建,再对高通量测序仪产出的数据进行信息分析的研究方法。lncrna-seq可---获得样本中全部的lncrnas信息,对lncrnas的类别、功能进行的深入分析,从而快速准确地获得与特定生物学过程(例如发育、---等)相关 lncrna信息。
注意事项
1. 为了避免蛋白---性,不要对样品剧烈搅动和反复冻融。
2. 缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环。。
3. 为了避免蛋白质的氧化,将 0.1~1 mmol/ldtt(二硫苏糖醇)(或 β-巯)加入到缓冲溶液中。
4. 为了避免重金属对目标蛋白的破坏,---多少钱,将 1~10 mmol/ledta 金属螯合剂加入。
5. 为了避免微生物生长,使用灭菌溶液。在纯化任何一种蛋白质的时候,均必须时刻对它的稳定性注意维护,使它的活性得到保护,需要牢记如下一些通用的注意事项。
6. 尽可能置于冰上或者在冷库内进行操作。
7. 蛋白浓度不要太稀。
8. 除非是进行---层。否则 ph 需要合适,防止所使用的缓冲溶液 ph 与 pi 相同,实时荧光定量pcr,使蛋白质的沉淀得以避免。
9. 使用蛋白酶,避免蛋白酶对目标蛋白的降解;在纯化细胞中的蛋白质时,将 dna 酶加入来使得 dna 降解,避免 dna 对蛋白的污染。
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