聚合酶链式反应(pcr)
操作步骤
1.在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
1qpcr buffer
5 μl
dntp mix( 2mm )
4 μl
引物1(10pm)
μl 2
引物2 ( 10pm)
2μl
taq酶(2u/ul)
1 μl
dna模板( 50ng-1μg/μl )
1 μl
加ddh2o至
μl 50
视pcr仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，---多少钱，立即置pcr仪上执行扩增。-般:在93°c
预变性3-5min ，进入循环扩增阶段: 93°c 40s***58°c 30s***72°c 60s ，苏州pcr，循环30-35
次，后在72°c保温7min。
3.结束反应， pcr产物放置于4°c待电泳检测或-20°c长期保存。
4. pcr的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油，需用100ul进行抽提反应混合液，以
除去石蜡油;否则，直接取5- 10μl电泳检测。
注意事项
1. 为了避免蛋白---性，不要对样品剧烈搅动和反复冻融。
2. 缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环。。
3. 为了避免蛋白质的氧化，实时荧光定量pcr，将 0.1～1 mmol/ldtt（二硫苏糖醇）(或 β-巯）加入到缓冲溶液中。
4. 为了避免重金属对目标蛋白的破坏，将 1～10 mmol/ledta 金属螯合剂加入。
5. 为了避免微生物生长，使用灭菌溶液。在纯化任何一种蛋白质的时候，均必须时刻对它的稳定性注意维护，使它的活性得到保护，需要牢记如下一些通用的注意事项。
6. 尽可能置于冰上或者在冷库内进行操作。
7. 蛋白浓度不要太稀。
8. 除非是进行---层。否则 ph 需要合适，防止所使用的缓冲溶液 ph 与 pi 相同，使蛋白质的沉淀得以避免。
9. 使用蛋白酶，避免蛋白酶对目标蛋白的降解；在纯化细胞中的蛋白质时，将 dna 酶加入来使得 dna 降解，避免 dna 对蛋白的污染。
3.引物的od数如何定量？
答：引物合成引物od数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm，石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度好稀释到0.2-1.0之间。dna干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测od值。需要根据稀释倍数换算出母液的od值。
4.需要什么级别的引物？
答：引物常用的纯化方式脱盐、biorp / opc纯化、page纯化、hplc纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。
----苏州pcr-南京英瀚斯由南京英瀚斯生物科技有限公司提供。“组织病理,细胞生物,分子生物学平台,动物模型科研外包服务”选择南京英瀚斯生物科技有限公司，公司位于：江苏省南京市栖霞区和燕路371号东南大学大学科技园科创楼a301，多年来，英瀚斯坚持为客户提供好的服务，联系人：戴经理。欢迎广大新老客户来电，来函，亲临指导，洽谈业务。英瀚斯期待成为您的长期合作伙伴！
联系我们时请一定说明是在100招商网上看到的此信息，谢谢！
本文链接：https://tztz316162.zhaoshang100.com/zhaoshang/281310664.html
关键词：
滇公网安备 53011202000392号