南京英瀚斯-细胞实验外包选-甘肃细胞实验

软琼脂培养克l隆形成试验基本步骤:

(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶---并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活l细胞计数，细胞实验外包选，用含20%胎牛血l清的dmem培养液调整细胞密度至1x106细胞/l。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。

(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40日中不会凝固。

(3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2xdmem培养基(含有2x和20%的小牛血l清)混合后，取3ml混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7~ 10ml)，冷却凝固，可作底层琼脂置co2温箱中备用。

(4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2xdmem培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2ml的细胞悬液，甘肃细胞实验，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37回5%co2温箱中培养10~14天。

(5)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞数。计算形成率。软琼脂培养法常用检测肿l瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40日。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克l隆形成试验。

软琼脂集落形成率实验(软琼脂克l隆)

将1.2%低熔点琼脂糖与2x细胞培养基以1:1的体积比混合制备0.6%的底层琼脂，6孔板中每个孔1.4ml温室凝固，取对数期细胞，胰酶---后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000个/ml，将0.6%低熔点琼脂糖与2x细胞培养基以1:1的体积比混合，制备0.3%的上层琼脂，每孔加1ml 上层琼脂和100ul单细胞悬液(约1000ell/wel)， 混匀，室温凝固。置于37目，5%co2的细胞培养箱中培养2-3周，计数含50个细胞以上得克l隆，计算细胞集落形成率，spotll 采集图像。

1、操作步骤 [方法一]：

(1) 细胞培养：取 6 孔培养板 (或用 35 mm 培养皿)，向每孔中加入 2 ml 含 1～2×105 个细胞培养液，37℃ co2 培养至 40%～60% 汇合时 (汇合过分，转染后不利筛选细胞)。

(2) 转染液制备：在聚---乙稀管中制备以下两液 (为转染每一个孔细胞所用的量)a 液：用不含培养基稀释 1-10 μg dna，终量 100μl，b 液：用不含培养基稀释 2-50 μglr，细胞实验外包，终量 100μl，轻轻混合 a、b 液，室温中置 10-15 分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染 (如出现沉淀可能因 lr 或 dna 浓度过高所致，细胞实验外包，应酌情减量)。

(3) 转染准备：用 2 ml 不含培养液漂洗两次，再加入 1 ml 不含培养液。

(4) 转染：把 a/b 复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃ 温箱置 6～24 小时，吸除无转染液，换入正常培养液继续培养。

(5) 其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。

注意：转染时切勿加，对转染效率有很大影响。