细胞实验外包选-细胞实验-英瀚斯

软gu细胞培养

(1)---脱颈处死，备皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮肤。

(2)无菌操作下取下双侧股骨头及膝关节(保留周围肌肉，软gu不能暴露)，75%酒精浸泡5分钟，转移至pbs缓冲液中，带入超净工作台，剔除关节周围附着的软组织，打开髋、膝关节，用尖刀削取关节软gu组织，置入装有pbs缓冲液的无菌培养皿，防止软gu组织被风干。

(3)pbs缓冲液充分漂洗软gu小块3次，细胞实验外包，然后用小剪刀将软gu块切碎至约imm3大小。

(4)再次用pbs缓冲液冲洗3次，滤干，将细小的软gu块置入放有0.2%的ii型胶原酶3ml的广口瓶里，摇匀后置于37°c恒温震荡箱中---，40分钟后将上层---液转移至15ml规格离心管中，800r/min离心5min，收集细胞(沉淀物)，加入含10%的胎牛xue清dmem培养液4ml并吹打混匀，制成软gu细胞混悬液。

(5)把---所得的软gu细胞混悬液收集于离心管中，经滤网过滤后用细胞计数板计数，并把细胞混悬液密度调整为2x105/ml接种于25cm2规格的培养瓶中。将培养瓶放置于co2培养箱内。培养条件为37°c、5%co2。

(6)未---完的软gu小块继续用ii型胶原酶如_上法---，直至软gu块基本消失。

(7)每日在倒置显微镜下观察软gu细胞生长情况并拍照保存。

三、自噬过程进行观察和检测

1、观察自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构，细胞实验外包选，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。phagophore的特征为:新月状或杯状，细胞实验外包公司，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(av1 )的特征为:双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(av2 )的特征为:单层膜，胞浆成分己降解。( autophagic vacuolo av )

2、在荧光显微镜下采用gfp-lc3融合蛋 白来示踪自噬形成由于电镜耗时长，不利于监测(monitoring) 自噬形成，人们利用lc3在自噬形成过程中发生---的现象开发出了此技术。无自噬时，细胞实验，gfp-lc3融合蛋 白弥散在胞浆中;自噬形成时，gfp-lc3融合蛋白转 位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

3、利用western blot检测lc3-ii/比值的变化以评价自噬形成自噬形成时，胞浆型lc3 (即 lc3-i)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即lc3-id，因此，lc3-ii/比值 的大小可估计自噬水平的高低。(注意: lc3对lc3-ii有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。)

4、mdc (monodansylcadaverine ，单丹---尸胺)染色:包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特---的。

5、celltrackertm green染色:主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特---的。