dna测序检测
1. pcr测序反应
(1)取0.2ml的pcr管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂:
所加试剂测定模板管标准对照管
bigdye mix
1μl
1μl
待测的质粒dna
1μ 1
pgem-3zf (+)双链dna
-1μ1
待测dna的正向引物
1μ 1
m13(-21)引物- 1μ 1
灭菌去离子水
2μ 1
2μ 1
总反应体积5μ 1，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧pcr管，用手指弹管混匀，稍离心。
(2)将pcr管置于9600或2400型pcr仪.上进行扩增。98c变性2min后进行pcr循环，
pcr循环参数为96c 10s，pcr， 50c 5s， 60°c4min，pcr， 25 个循环，扩增结束后设置4c保温。
2.---法纯化pcr产物
(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml ep管中。
(2)加入25μ 1/---混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀dna。12 000r/min于
4c离心30 min，小心弃上清。
(3)加70%(v/v)的---50μ 1 洗涤沉淀2次。12 000r/min 于4c离心5min，小心弃上清和
管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。
3.电泳前测序pcr产物的处理。
(1)加入12μ 1的tsr于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解dna沉淀，稍离心。
(2)将溶液转移至盖体分离的0.2ml pcr管中，稍离心。
(3)在pcr仪上进行热变性(95c 2min)，冰中骤冷，待_上机。
4..上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，实时定量pcr，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立
运行的测序顺序文件。
5.仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过
序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。
6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。
分子实验介绍——荧光定量pcr检测
荧光定量pcr是检测生物样品中rna含量的普遍的方法，通过荧光染料或荧光标记的特---的探针，对pcr产物进行标记---，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。目前主要使用sybr green和taqman法对rna含量进行检测。sybr green在低样本量时成本较低，目前选用的较多。
sybr green i是一种只与dna双链结合的荧光染料。当它与dna双链结合时，发出荧光；从dna双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链dna分子的数量。sybr green荧光染料法定量pcr的基本过程是：1、开始反应，当sybr green染料与dna双链结合时发出荧光。2、dna变性时，sybr green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成pcr产物。4、聚合完成后，sybr green染料与双链产物结合，定量pcr系统检测到荧光的净增量加大。
实验流程：细胞或组织rna提取-rna浓度检测-rna逆转录-定量pcr检测。
结果示例：
图 a 基因扩增曲线图；b 基因扩增溶解曲线图；c mrna相对表达量变化
从图中可以扩增曲线可以看出目的rna扩增效果，溶解曲线可以看出引物识别特---情况，通过使用δδct方法计算可以得到每个组中目的mrna表达变化。
25.pcr扩增不出就引物有问题吗？
答：基本不是。当今发展出各色各样的pcr扩增技术，各色各样的高温聚合酶，就是来解决pcr扩增中遇到的扩不出、扩增效率低的问题。如巢式pcr就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。 有些重复片段的扩增， gc含量高的片段，非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。
引物扩增不出，主要是下列两种情况比较常见：
（1） rt-pcr。请注意，很多基因通过常规rt -pcr方法是很难扩增出来的。 rt- pcr成功的关键在于rt的反应的rna和目标基因在特定组织和细胞中含量。
（2）从基因组中扩增。一般情况下，荧光定量pcr，基因在基因组中都是单拷贝，基因组作为模板需要严格控制用量。基因组dna过高，会影响反应体系中的mg和ph
pcr-南京英瀚斯生物科技-荧光定量pcr由南京英瀚斯生物科技有限公司提供。南京英瀚斯生物科技有限公司是江苏 南京 ,技术合作的见证者，多年来，公司贯彻执行科学管理、---发展、诚实守信的方针，满足客户需求。在英瀚斯---携全体员工热情欢迎---垂询洽谈，共创英瀚斯美好的未来。
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