英瀚斯-pcr引物设计-安康pcr

dna测序检测

1. pcr测序反应

(1)取0.2ml的pcr管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂:

所加试剂测定模板管标准对照管

bigdye mix

1μl

1μl

待测的质粒dna

1μ 1

pgem-3zf (+)双链dna

-1μ1

待测dna的正向引物

1μ 1

m13(-21)引物- 1μ 1

灭菌去离子水

2μ 1

2μ 1

总反应体积5μ 1，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧pcr管，用手指弹管混匀，稍离心。

(2)将pcr管置于9600或2400型pcr仪.上进行扩增。98c变性2min后进行pcr循环，

pcr循环参数为96c 10s， 50c 5s， 60°c4min，---多少钱， 25 个循环，扩增结束后设置4c保温。

2.---法纯化pcr产物

(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml ep管中。

(2)加入25μ 1/---混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀dna。12 000r/min于

4c离心30 min，小心弃上清。

(3)加70%(v/v)的---50μ 1 洗涤沉淀2次。12 000r/min 于4c离心5min，小心弃上清和

管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。

3.电泳前测序pcr产物的处理。

(1)加入12μ 1的tsr于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解dna沉淀，稍离心。

(2)将溶液转移至盖体分离的0.2ml pcr管中，稍离心。

(3)在pcr仪上进行热变性(95c 2min)，冰中骤冷，待_上机。

4..上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立

运行的测序顺序文件。

5.仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过

序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。

6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。

11.如何溶解引物？

答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mm tris ph7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，实时定量pcr，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的ph值比较低（ph4-5），pcr引物设计，引物在这种条件下不稳定。

12.如何保存引物？

答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高，合成的od数较大，建议分装，避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。