宁波pcr-英瀚斯生物科技公司-pcr实验室

22.同样的od用page检测，eb染色为什么深浅不一？

答：通常可以用eb染色的方法来判断双链dna的量(如质粒dna)，因为eb可以嵌合到双链dna中。而合成的单链dna，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，eb的染色程度也会有差异，比如oligo(dt)等不形成二级结构，eb染色效果就非常差。所以不要用eb染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。同样道理，用eb染色来照片不适合所有引物。

23.引物不纯会有什么后果？

答：引物不纯可能会导致：1)非特---扩增；2)无法用预先设计在引物5′端酶切位点的酶切开，---，---是没有保护碱基的引物；3) 用于测序出现双峰或乱峰。解决办法重新合成或重新纯化。

24.已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？

答：如果溶解引物的水ph过低或污染了菌或---酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻溶。建议使用10mmt ris ph7.5缓冲液溶解引物，因为有些蒸馏水的ph值比较低（ph4-5）， 引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题，而是pcr使用材料---是模板的与先前使用的不完全一致。

18.引物是经过page纯化的，为什么还有碱基缺失或插入？

答：理论---析型page变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备page电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，宁波pcr，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象，page纯化的引物，pcr实验室，---是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少od数，引物遇到的问题可能就会少一些。

19. taqman 探针设计的基本原则是什么？

答：下列原则供您参考。

◆taqman 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。

◆长度一般为18-40mer 。

◆g-c含量控制在40-80%左右。

◆避免连续相同碱基的出现，---是要避免gggg或更多g出现。

◆在引物的5端避免使用g。

◆选用比较多的碱基c。

◆退火温度tm控制在 68-70c   左右。

有用的荧光染料参数