活性氧检测试剂盒（reactive oxygen species assay kit）是一种利用荧光探针dcfh-da进行活性氧检测的试剂盒。dcfh-da本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，pcr检测，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成dcfh。而dcfh不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的dcfh生成有荧光的dcf。检测dcf的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。 本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂rosup以便于活性氧的检测。rosup是一种混合物（compound mixture），浓度为50mg/ml。
一、注意事项
1、探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
2、探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否---。
3、尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（---时间除外），以减少各种可能的误差。
4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴---手套操作。
dna测序检测
1. pcr测序反应
(1)取0.2ml的pcr管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂:
所加试剂测定模板管标准对照管
bigdye mix
1μl
1μl
待测的质粒dna
1μ 1
pgem-3zf (+)双链dna
-1μ1
待测dna的正向引物
1μ 1
m13(-21)引物- 1μ 1
灭菌去离子水
2μ 1
2μ 1
总反应体积5μ 1，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧pcr管，用手指弹管混匀，稍离心。
(2)将pcr管置于9600或2400型pcr仪.上进行扩增。98c变性2min后进行pcr循环，
pcr循环参数为96c 10s， 50c 5s， 60°c4min， 25 个循环，扩增结束后设置4c保温。
2.---法纯化pcr产物
(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml ep管中。
(2)加入25μ 1/---混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀dna。12 000r/min于
4c离心30 min，小心弃上清。
(3)加70%(v/v)的---50μ 1 洗涤沉淀2次。12 000r/min 于4c离心5min，小心弃上清和
管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。
3.电泳前测序pcr产物的处理。
(1)加入12μ 1的tsr于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解dna沉淀，实时荧光定量pcr，稍离心。
(2)将溶液转移至盖体分离的0.2ml pcr管中，稍离心。
(3)在pcr仪上进行热变性(95c 2min)，冰中骤冷，fish检测，待_上机。
4..上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立
运行的测序顺序文件。
5.仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过
序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。
6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。
3、参数设置
使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测---前后荧光的强弱。dcf的荧光光谱和fitc非常相似，可以用fitc的参数设置检测dcf。dcf的激发光谱和发射光谱参考下图。
4、其它说明
阳性对照可以按照1：1000的比例使用。例如装载好探针的细胞共1毫升，可以加入1微升的阳性对照---。通常---后20-30分钟内可以观察到非常---的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在---后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。
另外，对于某些细胞，盐城pcr，如果发现没有---的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1：2000-1：5000稀释dcfh-da，使装载探针时dcfh-da的浓度为2-5微摩尔/升。探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。
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