嘉兴pcr-英瀚斯生物科技公司-pcr实验室_南京其他分类

南京英瀚斯生物科技有限公司提供嘉兴pcr-英瀚斯生物科技公司-pcr实验室。

dna测序检测

1. pcr测序反应

(1)取0.2ml的pcr管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂:

所加试剂测定模板管标准对照管

bigdye mix

1μl

待测的质粒dna

1μ 1

pgem-3zf (+)双链dna

-1μ1

待测dna的正向引物

1μ 1

m13(-21)引物- 1μ 1

灭菌去离子水

2μ 1

总反应体积5μ 1，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧pcr管，用手指弹管混匀，稍离心。

(2)将pcr管置于9600或2400型pcr仪.上进行扩增。98c变性2min后进行pcr循环，

pcr循环参数为96c 10s， 50c 5s， 60°c4min， 25 个循环，扩增结束后设置4c保温。

2.---法纯化pcr产物

(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml ep管中。

(2)加入25μ 1/---混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀dna。12 000r/min于

4c离心30 min，小心弃上清。

(3)加70%(v/v)的---50μ 1 洗涤沉淀2次。12 000r/min 于4c离心5min，小心弃上清和

管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。

3.电泳前测序pcr产物的处理。

(1)加入12μ 1的tsr于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解dna沉淀，实时定量pcr，稍离心。

(2)将溶液转移至盖体分离的0.2ml pcr管中，稍离心。

(3)在pcr仪上进行热变性(95c 2min)，冰中骤冷，待_上机。

4..上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，嘉兴pcr，人工手动灌胶和建立

运行的测序顺序文件。

5.仪器将自动进行序列分析，pcr，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过

序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。

6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。

甲l基化特---的pcr

herman 等（ 1996 ）在使用重---酸盐处理的基础上新建的一种方法。该方法敏感性高，主要用于作定性研究。用------盐处理基因组dna，所有未发生jia基化的胞嘧定被转化为尿嘧ding，而jia基化的胞嘧定不变；随后设计针对jia基化和非jia基化序列的引物进行pcr。通过电泳检测msp扩增产物，pcr实验室，如果用针对处理后jia基化dna链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在jia基化；反之，说明被检测的位点不存在jia基化。

特点：适用范围广，能够检测特异位点是否发生jia基化。

------盐测序法（bisulfite sequencing pcr，bsp）

------盐修饰后测序法（ bsp ） frommer 等（ 1992 ）提出的研究 dna jia基化方法，此方法---性及jing确度高，能明确目的片段中每一个 cpg 位点的jia基化状态。用------盐处理基因组dna，所有未发生jia基化的胞嘧ding被转化为尿嘧ding，而jia基化的胞嘧ding不变。随后设计bsp引物进行pcr，在扩增过程中尿嘧定全部转化为胸腺嘧定，zui后对pcr产物进行测序就可以判断cpg位点是否发生jia基化，称为bsp-直接测序法。将pcr产物克long至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为bsp-ke隆测序法。

特点：jing确度高，能够准确检测出jia基化的程度百分比。

染色质免l疫共沉淀技术(chip)

基于体内分析而发展的染色质免l疫沉淀分析chr omat in immunoprecipitat ionassay kit， chip)技术可以真实、完整地反映结合在dna序列上的调控蛋白。由于chip采用甲醛固定活l细胞或者组织的方法，因此能比较真实的反映细胞内tf与promoter的结合情况，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来，这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌l症、心血l管病以及中央神经系统紊乱等---主要通路的一-种非常有效的工具。

染色质免l疫沉淀分析(chip) 的基本原理是在活l细胞状态下，当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白、蛋白与---(dna或rna)之间会产生共价键。细胞内，当f与promoter相互结合时，它们必然靠的比较近或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。固定的蛋白质dna复合物通过超声或酶处理将其随机切断为-定长度范围内的染色质小片段然后通过抗原抗l体的特---识别反应沉淀此复合体，特---地富集目的蛋白结合的dnal片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与dna相互作用的信息。通过qpcr或二代测序，筛选与目的蛋白互作的未知dna信息。

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