pcr-英瀚斯-pcr实验室

分子实验介绍——荧光定量pcr检测

荧光定量pcr是检测生物样品中rna含量的普遍的方法，通过荧光染料或荧光标记的特---的探针，pcr检测，对pcr产物进行标记---，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。目前主要使用sybr green和taqman法对rna含量进行检测。sybr green在低样本量时成本较低，目前选用的较多。

sybr green i是一种只与dna双链结合的荧光染料。当它与dna双链结合时，发出荧光；从dna双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链dna分子的数量。sybr green荧光染料法定量pcr的基本过程是：1、开始反应，当sybr green染料与dna双链结合时发出荧光。2、dna变性时，sybr green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成pcr产物。4、聚合完成后，sybr green染料与双链产物结合，定量pcr系统检测到荧光的净增量加大。

实验流程：细胞或组织rna提取-rna浓度检测-rna逆转录-定量pcr检测。

结果示例：

图 a 基因扩增曲线图；b 基因扩增溶解曲线图；c mrna相对表达量变化

从图中可以扩增曲线可以看出目的rna扩增效果，溶解曲线可以看出引物识别特---情况，通过使用δδct方法计算可以得到每个组中目的mrna表达变化。

凝胶阻滞迁移电泳检测服务（emsa）

凝胶迁移或电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay，emsa）是一种研究dna/rna结合蛋白和其相关的dna/rna结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。依据实验需要，设计标记探针、非标记探针、蛋白特---抗ti等参照物，基于dna-蛋白质或rna-蛋白质复合体在聚bing烯---凝胶电泳（page）中有不同迁移率的原理，当转录因子与特异的dna或rna结合后，其在page中的迁移率将小于未结合---白转录因子的dna，从而检测到活化的与dna或rna结合的蛋白转录或调节因子。

16.长链引物为什么出错的几率非常高？

答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%，产生碱基插入、缺失、置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是---pcr扩增，不可能---扩增产物中没有突变，引物合成也不可能---100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保---温聚合酶pcr扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。

17.如果测序发现突变，该如何处理？

答：遇到这种情况，首先和---合成厂家取得联系，生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，他们在电脑中一般会保留所有原始数据。在确认引物合成序列没有输错的情况下，建议重新挑取测序，pcr实验室，可能会找到正确的。根据经验，pcr，40个碱基以下的引物，测1-2个就可以了；40个以上的---是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。也可以要求公司将引物免费重合一次，pcr，不过重合的引物和次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。

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