分子实验介绍——荧光定量pcr检测
荧光定量pcr是检测生物样品中rna含量的普遍的方法，南京分子生物，通过荧光染料或荧光标记的特---的探针，对pcr产物进行标记---，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。目前主要使用sybr green和taqman法对rna含量进行检测。sybr green在低样本量时成本较低，分子生物学服务，目前选用的较多。
sybr green i是一种只与dna双链结合的荧光染料。当它与dna双链结合时，发出荧光；从dna双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链dna分子的数量。sybr green荧光染料法定量pcr的基本过程是：1、开始反应，当sybr green染料与dna双链结合时发出荧光。2、dna变性时，sybr green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成pcr产物。4、聚合完成后，sybr green染料与双链产物结合，分子生物工程，定量pcr系统检测到荧光的净增量加大。
实验流程：细胞或组织rna提取-rna浓度检测-rna逆转录-定量pcr检测。
结果示例：
图 a 基因扩增曲线图；b 基因扩增溶解曲线图；c mrna相对表达量变化
从图中可以扩增曲线可以看出目的rna扩增效果，溶解曲线可以看出引物识别特---情况，通过使用δδct方法计算可以得到每个组中目的mrna表达变化。
单核苷酸多态性( snp )实验
snp (single nucleotide polymorphisn即单核苷酸多态性 ，是由于单个核苷酸改变而导
实验方法原理:
snp (single nucleotide polymorphisn即单核苷酸多态性，是由于单个核苷酸改变而导
rna提取
1.弃去培养液，用pbs清洗两次1-2。
2.弃去pbs，用1000u1枪吸干净残余pbs。
3.加1ml trizol研磨b 41。
4. 1.5miep管标号与每孔相对应备用。
5.研磨好的溶液转移至对应的 ep管。
6.往每个ep管中加入250ul，剧烈震荡30s， 冰上静置12min[问l。
7. 所有样品4c离心，转速: 13500转1分钟，时间: 15min.
8. 再次标记一批同样编号ep管。
9.离心后吸上清液400u1移入相应编号的ep管中，再加入400ul异充
分混匀。4c冰箱35min。
10. 4c离心，转速: 13500转1分钟，时间: 10min.
11.弃去.上清液，加1m175%---，轻摇7]。
12. 4c离心，10600转/分钟，时间: 5min.
13. 弃上清液滤纸吸干。
14. 加depc水10ul溶解，-80c保存。进行逆转录前测浓度。
组织rna提取
1、剪米粒大小组织块放入ep管中标号。
2、ep管中加300ul trizol浸泡30分钟或更久。
3、用研磨棒研磨，以肉眼很难看到组织为宜。
4、加700u1 trizol静 置5分钟。
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