分子生物检测-英瀚斯-南京分子生物

二、大肠菌群检验方法:

由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的---，即:需氧及兼性厌氧、在37°c能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。 目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有---和原商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。

(一)---:---采用三步法，即:乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。乳糖发酵试验:样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36士1c培养48土2h，观察是否产气。分离培养:将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36士1°c培养18-24h，观察菌落形态。证实试验:挑取平板上的菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36士1°c培养24土2h，观察产气情况。

报告:

根据证实为大肠阳性的管数，查mpn表，报告每100ml ( g)大肠菌群的mpn值。具体操作参见gb4789. 3-94 <---------食品卫生微生物学检验大肠菌群测定>

(二)原商检局制订的行业标准，等效采用美国fda的标准方法，用于对出口食品中的大肠进行检测。本方法采用两步法：推测试验:样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管lst肉汤。36士1c培养48士2h，观察是否产气。证实试验:将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐(bglb)肉汤管中，36士1°c培养48士2h，观察是否产气。以bglb产气为阳性。查mpn表，报告每ml(g)样品中大肠菌群的mpn值。具体操作参见sn0169-92<------进出口商品检验行业标准 出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠检验方法>

动物组织细胞基因组dna提取

操作步骤

1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，小分子生物检测服务，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶k

（500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另

一离心管中。

2.加2倍体积异，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul te 重新溶解。（可进行pcr反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）

3.加等量的酚??振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

4.取上层溶液至另一管，加入等体积的?，振荡混匀，离心12000 rpm，分子生物检测，5min。

5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/l氨加入2倍体积的无水---，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ，10min。

6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。

7.用1ml 70%---洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。

8.小心倒掉上清液，南京分子生物，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。

9.加200ul te重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?c20℃保存备用。

10.吸取适量样品于genequant上检测浓度和纯度。